液质联用仪分析炸薯条中的丙烯酰胺

前言 2002 年，瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学的研究人员发现，马铃薯和谷类制品， 如薯片、薯条、烤土豆、面包、早餐麦片和饼干中的丙烯酰胺含量可高达 3 毫克/公斤。 高碳水化合物食品在高温 (>120 °C) 条件下会产生丙烯酰胺，如油炸、烘烤和挤压 (1)。对 于动物，它是的一种神经毒素和致癌物质。国际癌症研究机构(IARC)认为它可能使 人致癌 (2)。高浓度的丙烯酰胺主要存在于马铃薯制品，面包和谷物产品，以及咖啡中。丙 烯酰胺是在食品进行高温处理时生成的,产生原因是某些氨基酸与还原糖发生了美拉德反 应 (Maillard) (1)。大多数实验室使用液相色谱/三重四极杆质谱 (LC/ MS / MS) 检测食品 中的非衍生丙烯酰胺。液相色谱方法采用水提取食品中的丙烯酰胺。用正己烷、甲苯或 环己烷除去脂肪，然后对水相进行离心 (3)。根据美国食品药品管理局 (FDA) 的方法，使用 固相萃取 (SPE) 进行样品的净化 (4)。

QuEChERS 方法最早用于食品中农药残留的分析，后来被 Mastovska 和 Lehota 修改之后，可用于食品中丙烯酰胺的提取 净化 (5)。方法包括两个主要的步骤：提取和分散固相萃取净化。用 水提取样品，正己烷除去脂肪，硫酸镁和氯化钠促使乙腈和水相 分层，使丙烯酰胺进入乙腈中。取一定体积的有机相用分散固相 萃取进行净化，利用 N-丙基乙二胺 (PSA) 去除有机酸，无水硫酸镁 除去有机相中的水。最后用三重串联四极杆液质联用仪的正离子 多反应监测模式 (MRM) 进行样品的分析。 本应用简报介绍了用 LC/MS/MS 检测炸薯条中丙烯酰胺的方法。 方法包括采用安捷伦 Bond Elut QuEChERS 提取试剂盒 (p/n 5982-5850) 和 Bond Elut AOAC 分散固相萃取 2 mL 试剂盒 (p/n 5982-5022) 进行样品前处理。

实验部分 试剂和化学品 所有的试剂都是 Optima 或 LC/MS 级的。乙腈、正己烷、甲酸和 水都是从 Fisher Scientific (Hanover Park, IL, USA) 购买的。丙烯 酰胺（图 1）和同位素的 13C3-丙烯酰胺（内标）是从 Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA) 购买的。 标准溶液 丙烯酰胺标准储备液 (1 mg/mL) 用 100 毫克丙烯酰胺溶于 100 毫升的乙腈制备，并储存在 4 °C 条件下。内标（甲基丙烯酰胺） 储备液 (100000 µg/mL) 用移液枪取 0.5 mL 浓度为 1 mg/mL 的 标准溶液溶于 50 毫升的乙腈制备，并储存在 4 °C 条件下。所有的 工作标液都是每天采用序列稀释法用乙腈新鲜配置的。

设备和材料 样品分析是在安捷伦 1200 系列液相色谱和 6460 三重串联四极杆液质联用仪上进行的 (Agilent Technologies, Inc., CA, USA)。组分 的分离采用 C18 色谱柱 (2.1 mm × 150 mm, 3 µm)，用安捷伦 MassHunter 软件进行数据处理。 用 Bond Elut QuEChERS 丙烯酰胺提取试剂盒 (p/n 5982-5850) 和安捷伦 Bond Elut QuEChERS AOAC 分散固相萃取试剂盒 (p/n 5982-5022) 进行样品的提取和净化。

样品制备 冷冻炸薯条从当地的商店购买。 提取 称取 1 克炸薯条放入 50 毫升的安捷伦的 Bond Elut QuEChERS 离心管中。加入内标（13C3 丙烯酰胺），浓度为 500 ng/g。加入正 己烷 (5 mL) 并涡旋振荡。加入 10 毫升水和 10 毫升乙腈，然后是 Bond Elut QuEChERS 提取混合物 (p/n 5982-5850)。振荡 1 分钟， 在 5000 转下离心 5 分钟。

分散固相萃取净化 弃去正己烷相，将 1 毫升乙腈提取液转移至 2 毫升 Bond Elut QuEChERS AOAC 分散固相萃取管中 (p/n 5982-5022)。管中包含 50 毫克的 PSA，150 毫克的无水硫酸镁。振荡 30 秒，然后在 5000 转下离心 1 分钟。上清液转移至自动进样器的样品瓶中用于 液质分析。

结果和讨论 色谱分析 丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺的分离是在 C18 柱上进行的 (2.1 x  150 mm, 3 µm)，采用等度洗脱，2.5% 的甲醇/97.5% 的 0.1% 甲 酸水溶液。柱温是 30 °C，流速为 0.2 mL/min。图 3 为丙烯酰胺和 甲基丙烯酰胺分离的典型的色谱图。

QuEChERS 方法 正己烷用于去除样品中的脂肪。加入水以利于提取薯条中的丙烯 酰胺。包含 4 g MgSO4 和 0.5 g NaCl 的 QuEChERS 提取盐包用于 提取 1 克薯条中的丙烯酰胺。加盐的目的是促使乙腈和水更好地 分层。分散固相萃取被用于样品的净化(5)。 本应用中的 QuEChERS 前处理步骤很简单。不再需要耗时、繁琐 而且还可能导致回收率损失的固相萃取步骤。

线性 线性校正曲线是用分析物的相对响应（待测物丙烯酰胺与内标物 甲基丙烯酰胺的峰面积比值）对分析物的相对浓度（待测物丙烯 酰胺与内标物甲基丙烯酰胺的浓度比值）作图建立的。丙烯酰胺 的浓度范围为 0 – 1000 ng/mL（图 4）。线性度非常好 (r2>0.9999)。

回收率和重现性 浓度分别为 50 和 100 ng/mL 的丙烯酰胺加标的 1:1 乙腈水溶液。 每个浓度水平重复三次(n=3)。用含有 33 ng/mL 丙烯酰胺的薯条 分别添加两个浓度水平的丙烯酰胺（100 和 200 ng/mL）制备加标 样品以及不加标的空白校正样品，这是因为很难找到空白的 薯条样品。加标薯条样品的色谱图见图 5。分析重复三次(n=3)。 表 2 是丙烯酰胺的回收率和相对标准偏差。

结论 基于安捷伦 Bond Elut QuEChERS 的样品前处理方法用于丙烯酰 胺的提取和净化，LC/MS/MS 用于定量分析，开发了简单快速 的多残留分析方法，具有高回收率以及高重现性，这个方法可以 用于监测食品中的丙烯酰胺。