用LC/MS/MS 测定食品中44种农药的含量

农药在农业活动中应用广泛，主要用于两个方面，即 生产和为方便运输进行的农产品处理。而被限制使用 的农药是主要用于农业生产的农药。因此，农药最大 残留量 (MRLs) 与食品的安全评价有着紧密的联系。近年来建立的 MRLs 相关法规日趋严格。日本在 2006 年出台了肯定列表制度 (Positive list system)，对食 品中 500 余种农药的 MRLs 作了规定。这一制度针 对不同农药，按不同食品规定了不同的 MRLs。 通常，根据商品和农药种类的不同，MRLs 在 0.01 到 3 µg/g 不等。MRLs 的降低对仪器的灵敏度提出 了更高的要求，促使仪器不断发展以满足复杂样品的 要求。迄今，带有多反应监测模式 (MRM) 高 效液相色谱/串联质谱系统 (LC/MS/MS) 是食品中极 性农药定量分析常用的工具。MRM 模式能够对食 品这样的复杂基质进行更精确的检测。本文在所用样 品分析条件下分两次分析了 44 种农药（见表 1 和表 2），其灵敏度能够很轻易地达到肯定列表制度的相应 要求。

实验部分 化学试剂 乙腈（LC/MS 级纯）购自 Wako Pure Chemical Ind. （日本）。 正己烷，甲酸，氯化钠和无水 硫酸钠均为分析纯，购自 Wako Pure Chemical Ind. （日本）。SPE 柱购自 Spelco Japan（日本）。各农药 标准品购自 Hayashi Pure Chemical（日本）。

样品制备 提取 蔬菜和水果样品均来自本地市场。用食品加工机将 10-500 g 不等的样品切碎，获得混合的匀浆液。 称量 20 g 的样品匀浆液倒入 200 mL 的 PTFE 离心 管中，加入 50 mL 乙腈在 Polytoron 混合器中混匀。 将乙腈提取物抽真空过滤，收集滤液。滤渣再以 20 mL 乙腈提取。重复上述操作后合并滤液，倒入 100 mL 容量瓶中，加入乙腈定容。取出 20 mL 提取物倒入 PTFE 离心管中，加入 10 g NaCl 和 20 mL 磷酸盐缓 冲液 (pH 7.0)，振摇 5 分钟。盐析后得乙腈层，向其 中加入 5 克无水硫酸钠。去除无水硫酸钠后，使用旋 转蒸发仪在 40 °C 下将乙腈提取物蒸干。残渣以 2 mL 乙腈－甲苯 (3:1) 溶解。

纯化 第一组－将提取物上样到经 10 mL 乙腈－甲苯 (3:1) 平衡过的 GCB/氨丙基 SPE 柱 (500 ng/500 mg) 上。 以 20 mL 的乙腈－甲苯 (3:1) 冲洗。收集洗脱液，以 旋转蒸发仪蒸干溶剂。残渣以 4 mL 甲醇溶解。 第二组－将提取物上样到经甲醇、丙酮、正己烷各 10 mL 依次平衡过的硅胶 SPE 柱 (500 mg) 上。以 10 mL 的丙酮-三乙胺-正己烷 (20:0.5:80) 洗脱。弃去 洗脱液。再以 20 mL 丙酮-甲醇 (1:1) 冲洗，收集洗 脱液，旋转蒸发仪蒸干溶剂。残渣以 4 mL 甲醇溶解

标准溶液配制 配制 1 µg/mL 的各农药标准品的甲醇溶液，以甲醇 逐级稀释得 0.001-1 µg/mL 的标准混合液。 空白基质残渣中加入混合农药，浓度为 10 ng/g。

LC/MS/MS 仪器 LC/MS/MS 系统包括 Agilent 1100 系列的真空脱气 机，二元泵，自动进样器，柱温箱和 Agilent G6410 型三重串联四极杆质谱，离子源是 ESI 源。本研究的 目的是建立一种快速灵敏测定水果和蔬菜中农药残留 量的分析方法。为了获得良好的色谱分辨率和灵敏度， 需要首先优化流动相组成和选择合适的色谱柱。优化 结果为：流动相采用水-乙腈-甲酸-甲酸铵体系，色谱 柱采用 1.8 µm 粒径填料的 C18 柱。

LC 条件 仪器： Agilent 1100 HPLC 色谱柱： ZORBAX Extend C18, 100 mm x 2.1 mm,  1.8 µm (部件号728700-902) 柱温： 40 ºC  流动相： A = 0.1% 甲酸 +5 mM 甲酸铵水溶液 B= 乙腈 洗脱梯度： 起始 10% B，at 30 min 80% B 流速： 0.2 mL/min  进样量： 5 µL MS 条件设置 仪器： Agilent 6410三重串联四极杆系统） 离子源： ESI 正离子模式 干燥气流速： 10 L/min 雾化器： 50 psig 干燥气温度： 350 ºC  Vcap: 4000 V 离子扫描范围： m/z 100-550  碰撞电压： 100 V 可调 MRM 离子： 见表 1 和表 2 碰撞能量： 见表 1 和表 2

LC/MS/MS 方法 以 MRM 模式按时间程序进行定量分析。MRM transition 参数见表 1 和表 2。

结果与讨论 MRM transition 条件的优化 对含 1 µg/mL 的两个农药的混合物标准溶液依次进 行全扫描模式和子离子扫描模式的检测，获得各个农 药的最佳 MRM transition 参数。两种模式的总离子 流图 (TIC) 见图 1 和图 2。在全扫描模式的质谱图中， 除了 azinphos-methyl，呋线威和氟磺胺草醚的基峰 离子是 [M+NH4]+ 之外，其余农药的基峰离子都是 [M+H]+。选择这些基峰离子作为母离子进行 MRM 模 式监测。采用多重采集 (multiple acquisition) 和时 间程序模式，可以得到不同农药的个体子离子 MS/MS 图谱。从表 1 和表 2 中可以看出，第一组的 33 种农药和第二组的 11 种农药分别以 10 个和 7 个 时间段进行 MRM 模式监测。 图 3 是最小 MRL 浓度水平 (10 ng/mL) 的农药标准 混合液的 TIC 谱图。图中所有的农药都显示了信噪比 (S/N)。以 MRM 模式分析 1 ng/mL 各农药 溶液（结果见表 3），按照信噪比 S/N=3 确定各农药 的检出限 (LOD)。同时，分析 0.001-1 ng/mL 的各农 药标准溶液，绘制定量标准曲线，评价其线性。表 3 数据显示，所有农药的线性相关系数 r2 都大于 0.998。 为了考察基质对方法的影响，本文选取柑桔、苹果、 马铃薯和卷心菜为基质。向各自的提取物中分别加入 10 ng/mL 的农药标准品后进行分析。图 4 和图 5 是 柑桔提取物的 MRM 图谱，其他提取物的分析结果见 图 6。通过与农药标准混合液的图谱比较，可以看出， 基质的成分对农药的检测没有干扰。这表明，MRM 模式具有很高的选择性。