中药注射剂评价特色分析方案丨LCMSMS测定注射剂对细胞培养上清液中组胺含量

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l                      类过敏反应

类过敏反应是中药注射剂临床应用过敏反应常见类型，是非经典途径的免疫反应，其主要机制是细胞受到外界物质刺激发生反应后分泌组胺、蛋白酶和花生四烯酸等过敏性介质。组胺则是过敏反应中最主要的活性过敏介质之一，可导致机体产生潮红、头痛、水肿、低血压以及休克等症状。通过中药注射剂对细胞培养液反应，检测组胺等过敏介质的含量，对判断中药注射剂发生类过敏的风险具有一定的应用价值。 

l                      组胺检测方法

由于生物样品中组胺的含量低，量化组胺需要高灵敏度的分析方法。目前，组胺的检测方法主要有 ELISA 检测法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱和离子色谱法等。

l                      分析条件

液相条件

HILIC色谱柱(2.1 mm I.D.x150 mm L.3 um)

流动相：A 相 -20mM 乙酸铵 +0.1% 甲酸水溶液  B相-乙腈

流速：0.4 mL/min

柱温：40℃

进样量：5 μL

洗脱方式：等度洗脱，A:B=10:90(V/V)

质谱条件

离子化模式：ESI,正离子模式

离子喷雾电压：+4.5 kV

雾化气流速：氮气 3.0 L/min

干燥气流速：氮气 15 L/min

碰撞气：氩气

加热模块温度：400℃

扫描模式：多反应监测(MRM)

驻留时间：50 ms

延迟时间：3 ms

DL管温度：250℃

MRM优化参数

l                      样品的处理

取培养一段时间后的细胞培养液，注射入中药注射试剂刺激细胞后取细胞上清液，并在 0~4℃以3000 r/min 离心10 min，取上清液至进样小瓶中，从中取 100 μL 至另一离心管中加入 20 μL内标溶液，加入200 μL乙腈，充分挑匀室温 15000 rpm,15 min 再次离心。取 100 μL 上清液加入 900 μL超纯水充分振匀后直接上样分析。

l                      分析结果

标样的MRM色谱图（10ng/mL）

线性关系

组胺校准曲线

重复性实验

配制目标物浓度分别为 1、10、100 ng/mL 的混合标样，平行测定各3次，考察仪器的重复性，保留时间和峰面积重复性结果如下表所示，仪器重复性良好。

回收率及精密度实验

称取组胺标准品，以阴性细胞上清液溶解，使其质量浓度为1、10、100 ng/mL，按 前述“0~4℃以3000 r/min 离心10 min……取 100 μL 上清液加入 900 μL超纯水充分振匀后直接上样分析。”处理后，对样品进行3个加标水平的回收率实验，每个加标水平平行测定3次， 3 个加标水平的平均回收率为 90.4%~93.8%，相对标准偏差为 4.75%~5.78%。结果表明方法的回收率和精密度均较好。

LC-MS/MS测定中药注射剂对细胞培养上清液组胺含量的分析方法，方法稳定、特异性和灵敏度均较高，重复性好。因此，本方法可用于测定中药注射剂对细胞培养上清液中组胺含量，对判断中药注射剂发生过敏的风险具有一定的应用价值。

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