快速相色谱/串联质谱分析血清中的da麻素和苯bing胺类药物

引言在美国和欧洲 ，da麻是最常见的滥用药物 。而且像ben丙胺化合物的类交感神经药物的滥用程度在过去几年大幅增加 。由此导致越来越严重的交通安全问题 。针对这个问题 ，在 1998 年德国道路交通法将对服用da麻素 ，以及它们的亚甲基二氧基衍生物 ，MDMA 及 MDE 之后驾驶的行为进行处罚 。自此之后 ，血液中四氢da麻酚(THC)或ben丙胺的检测量快速增加 。因此 ，各实验室迫切需要能够快速分析大量样品的方法及手段 。液相色谱/质谱/质谱是最合适的技术 。ben丙胺是一种碱性化合物 ，特别是电喷雾离子化的模式 ，而极性较弱的da麻素则在大气压化学电离源模式下具有较好的灵敏度（见图 1）。为了实现在一次进样就可分析两种化合物 ，使用安捷伦组合离子源(G1978B)以实现所有的分析目的 。组合源可以单独进行电喷雾 ，大气压化学源或者两种模式同时进行 。模式和参数也可以时间编程 。

试剂所有的溶剂和试剂都是分析纯 。甲醇 ，丙酮 ，醋酸 ，二氯甲烷 ，异丙醇和氨水来自默克公司 。固相萃取柱采用 Baker 公司 ，所有的药物标准品和氘代标准品来自 Cerilliant (Austin, TX)。

样品制备1 毫升的血清 ，用 6 毫升磷酸缓冲液(0.1 M, pH 6)稀释 。加入 50 微升内标混合液（浓度为 ，每微升含1ng 的 D5-MDA,D5-MDMA, D6-MDE 和 D9-THC-COOH 与 D3-THC 和D3-THC-OH) 每种 0.1 ng/µL 。溶液混合 3 分钟 ，然后在 3000 转下离心 10 分钟 。固相萃取系统可以采用自动化 ，如 Caliper Rapid- Trace SPE 工作台 ，或者手动系统 。上清液加入预先活化的萃取柱(Bakerbond SPE C18,500 mg),活化步骤是先用 3 毫升甲醇冲洗两次 ，然后用 2 毫升水冲洗一次备用 。样品溶液经过之后 ，用水淋洗两次 ，再用 80:20; v/v 的水/甲醇淋洗两次 ，最后用 0.1M 甲酸溶液淋洗一次 。萃取柱干燥10 分钟 。洗脱分两步 。首先用 3 毫升的 50:50; v/v 的二氯甲烷/丙酮将da麻素洗脱出来 ，然后用 40:10:2; v/v/v的二氯甲烷/异丙醇/氨水将苯bing胺 ，阿片 ，以及代谢物洗脱出来 。将两个洗脱液合在一起 ，在 30 °C 下氮气吹干 ，用 100 微升甲醇再溶 。最后用水稀释(1:4),以改善色谱峰形 。

液相色谱/质谱/质谱液质联用系统包括 1200 高分离度快速液相色谱(RRLC)和 6410 串联四极杆质谱仪 。不同的流动相 ，流速 ，色谱柱参数来筛选适合的 ZORBAX 的色谱柱以获得最佳的分离度和最快的分析速度 。

方法认证液相/质谱/质谱方法验证用血清中 THC, THC-OH,THC-COOH, MDA, MDMA 和MDE 的定性和定量来完成 。验证程序根据 Peter[1]和德国毒物及法医化学协会的相关规定和方法进行 。在方法验证中使用基于微软 Excel 的验证程序(VALSTAT[2])。不含药物的血清作为空白基质用于方法验证 。采用 7 点校正曲线 。每个水平都是空白血清加 50 微升含药物的甲醇溶液 。校正曲线见表 4。

7 点校正曲线 ，其中每个数据点重复六次 。校正曲线采用线性模式 ，对于大多数的化合物其相关系数大于 0.99。以第三个校正点的信噪比计算出定量限（峰-峰比 ）。所有的定量离子和定性离子都被准确地测量 ，即使为了提高峰形而采用1:4 的水稀释样品 ，其具有很好的信噪比（见图 4）。日内测定和日间分析结果精密度是在以下条件进行的 ：两个浓度水平（低 ，高浓度 ）在八天数据的结果计算而得 。日内测定的精密度是从一天之内两个浓度水平的样品八次结果的变异系数计算得出 。日间测定精密度是从八天测得结果的平均值 。日内测定精密度在 2.9-15.3% 之间（表 5）。日间测定精密度在 3.4-15.3% 之间 。

结论使用 1.8 µm 粒径色谱柱的液相分离（12 分钟 ），获得了比气质联用分析更快的分析速度（45 分钟 ）。由于两类化合物的极性不同 ，因此采用了组合离子源以使每个化合物都获得最佳的相应（利用时间编程进行采集模式切换 ）。与现有的气质联用分析方法相比 ， 高分离度快速液相色谱/串联质谱系统可以获得更高的灵敏度和选择性（对于气质分析 ，进样体积一般是 1 微升 ，而液质分析的条件是 ：样品在进样前稀释 4 倍 ，进样体积是 10 微升 ）。日间和日内测定精密度也很好 ，变异系数在 3-15%之间 ，而且大多数的化合物的精密度在 5-10%之间 。其它的滥用药物也将被包括在此液相色谱/质谱/质谱方法里 。其中在线固相萃取也将被评价 。