液相色谱-串联质谱联用技术用于牛奶中多残留四环素及其代谢物的检测

摘要四环素类抗生素最频繁地被用于畜牧行业中。本文介绍了液相色谱-串联质谱联用技术同时检测牛奶和动物组织中的 10 种抗生素残留，包括二甲胺四环素、差向土霉素、差向四环素、四环素、差向金霉素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、多西环素和土霉素。安捷伦固相萃取柱和反相 Agilent ZORBAX RX C8 column (5 µm, 150 mm × 2.1 mm)色谱柱在此方法中被用于样品的纯化和分离。各组分的检测限介于 0.5 至 10.0 µg/kg 之间，定量限(LOQ) 小于 50 µg/kg。 线性校正曲线的范围是 5 至 1000 µg/kg。总回收率在76.4% 至 101% 之间，相对标准偏差 (RSD, n = 6) 小于 8.4%。本方法快速、灵敏、方便、可靠，可以用于牛奶中多残留四环素及其代谢物的同时检测。

前言抗生素在世界范围内被广泛地用于控制细菌感染和促进健康家畜的奶产量。四环素类抗生素是一类广普抗生素，因而被广泛使用。但是，在奶及奶制品中含有这些抗生素会影响奶的安全性。美国食品药品管理局(FDA) 限定了四环素，包括土霉素和金霉素的日允许摄入量(ADI)和牛奶中允许xian量。这些化合物总残留的日允许摄入量(ADI)是每天每千克体重 25 微克。日允许摄入量(ADI)的60%是用于牛奶，40% 是可食组织。根据日允许摄入量（ADI），牛奶中四环素类，包括土霉素、金霉素和四环素的总残留xian量不能超过 300ppb。四环素的总残留被设定为 300ppb，三种四环素中每个组分的阈值为 300ppb 也能被接受。在欧盟，根据欧盟 2377/90 号法令建立的牛奶中四环素的最大残留xian量为 100 µg/kg (100 ppb)。在中国，国标 (GB/T 21317-2007)也设定了牛奶和动物组织中这些化合物的确定方法。该法规于2008 年 4 月 1 日正式生效。本研究的目的是建立利用 Agilent 6410 LC/MS/MS 系统检测牛奶中四环素及其代谢物的方法。本方法快速而易用。四环素及其代谢物的结构见表 1。

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实验部分化学试剂和化学品液相色谱级的水和甲醇，以及甲酸全部购自 Fluka。标准品都购自Sigma-Aldrich。

样品前处理提取步骤：1. 称 5 克牛奶样品（精确至 0.01 g）加入到 50 毫升比色管中，溶于 0.1 M/L Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲液，定容至 50 毫升2. 涡旋震荡 1 分钟，提取液在冰水混合液中超声 10 分钟3. 将样品转移至 50 毫升聚丙烯离心管中并冷却至 0 °C ~ 4 °C4. 样品在 15 °C 下， 5000 r/min 离心 10 分钟5. 快速滤纸过滤净化：1. 取 10 毫升提取液（相当于 1g 样品），倒入安捷伦 SampliQOPT 型固相萃取柱（部件号 5982-3036），速度为每秒一滴2. 当它洗脱后，调节 3 mL 水至 pH 4.5 清洗固相萃取柱，然后丢弃所有流出物3. 在 2.0 kPa 的负压下，抽固相萃取柱 5 分钟4. 用 10 mL 的 10 mmol 乙二酸的甲醇溶液洗脱5. 收集洗脱液，在 40 °C 下氮气吹至干6. 用 1 mL 的初始流动相溶解残留物7. 用 0.45 µm 的滤膜过滤，然后进样

结果与讨论优化和分离碰撞诱导解离电压和碰撞能量(CE)优化，三重串联四极杆液质联用系统是识别、确认和定量食品基质中目标化合物的最佳工具。为了获得最高的响应，仅仅每个组分的两个参数被用于质谱优化，即碰撞诱导解离电压和碰撞能量。合适的碰撞诱导解离电压是为了将母离子传输至质量分析器。合适的碰撞能量提供合格子离子的最高丰度的定量。一种优化方法是在一次运行中设定不同的碰撞诱导解离电压段来多次进样。图 1 是二甲胺四环素采用该方法的图示。结果表明，对于二甲胺四环素，随着电压增加，母离子响应增加很少。采用同样的方式优化碰撞能量，四环素的结果见图 2。

最近安捷伦公司推出了方法自动优化（Optimizer）程序，它可以自动进行碰撞诱导解离电压和碰撞能量的优化，最后将优值存于 Optimizer 数据库中。 利用这个程序和带色谱柱或不带色谱柱的流动进样模式，用户只要输入要优化的化合物名称和分子式即可。表面质量会根据分子式自动被计算出来。用户需要正模式或负模式下可能的加合物、小质量去除、任何需要排除的离子以及需要采用的方法（流动相条件等）。一旦开始运行，程序通过用户选择的一次进样增加量开始进样，确定母离子并利用步进式的电压梯度进行碰撞诱导解离电压的优化。然后程序选择电压产生最高丰度的母离子。图 3 是四环素采用该方法的结果。

随后二次进样开始进行子离子扫描，然后选择四个最高丰度的子离子。重复进样并运行 MRM 采集每个离子的碰撞能量。那些生成信号子离子响应的碰撞能量会自动确定并存入数据库。对于四环素碰撞能量的结果列于图 4，图 5 是离子碎裂曲线。带子离子的化合物会直接被导入用户的现有分析方法中。