液质联用进行菠菜中残留农药检测

摘要本应用方法介绍了一种简单、快捷、廉价、有效、耐用、安全的(QuEChERS) EN 样品制备方法及其应用，该方法可用于菠菜中 13 种具代表性的不同种类残留农药的萃取和净化。菠菜被认为是一种高色素基质，而用于高色素瓜果和蔬菜的 EN 分散固相萃取试剂盒是有选择性的。试剂盒中将添加了 7.5 mg/mL 石墨化碳黑（GCB）的乙腈萃取剂。通过液相色谱和电喷离子化串联质谱仪联用（LC-ESI-MS/MS），正离子模式多重反应监测模式（MRM）测定菠菜萃取物中的残留农药。通常认为 GCB 对平面结构的农药萃取有显著的负影响。但是，本文研究结果显示在 EN 分散固相萃取试剂盒中添加少量 GCB 时对平面结构农药的影响可以忽略，所得定量结果也是可以接受。本指南给出的菠菜中农药的定量限（LOQ）为 5 ng/g，大大低于最高允许残留（MRL）。回收试验的加标水平分别为 10、20、200 ng/g，表明回收率在 60%-99%范围内（平均 85.4%），相对标准偏差低于11%（平均 5.5%）。

引言EN QuEChERS 方法被广泛的用于食品中的农药分析，特别是在欧洲。该方法采用乙腈作萃取剂，然后通过利用无水硫酸镁、氯化钠和柠檬酸盐缓冲液从样品中的盐析出水来诱导液-液分层。为了净化的需要，采用了分散固相萃取步骤，结合乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)的使用以除去脂肪酸及其它组分，无水硫酸镁则用来吸收萃取物中的残留水。根据不同的食物基质，该步骤中可能会增加其它成分，如用于除去色素和甾醇的石墨化炭黑（GCB）或者用于除去更多类脂和脂肪油的 C18 等。由于含有高浓度的叶绿素，菠菜被认为是一种高色素蔬菜。因此，本应用选用适用于高色素量商品的 EN 分散固相萃取试剂盒。在这些试剂盒中，除了 25 毫克 PSA 和 150 毫克 MgSO4 外，每毫升乙腈萃取剂中还加入了 7.5 毫克 GCB。GCB 可以吸附平面分子如色素和甾醇，因此它对于净化色素基质如菠菜是非常有帮助的。GCB 添加量越大，平面分子吸收得越多，可得到更干净基质的样品。EN 法和 AOAC 法在净化高色素基质方面的主要区别是在分散固相萃取步骤中 GCB 添加量不同是。AOAC 法中 GCB 的添加量较高（每毫升乙腈萃取剂中添加 5 毫克 GCB），EN 法中 GCB的添加量较低 (处理“有色”产品时，每毫升乙腈萃取剂中添加2.5 毫克 GCB；处理“深色”产品时，每毫升乙腈萃取剂中添加7.5 毫克 GCB)。GCB 对平面农药萃取的影响随所用方法的不同而有所区别。AOAC 法可制得基质更干净的样品，但是易造成平面农药分子的大量损失；与此相反，EN 法造成的平面农药分子损失较少，但样品基质更为复杂。

之前，我们曾介绍过一种改进的 AOAC 法，即在分散固相萃取中添加甲苯可明显提高高色素基质（如菠菜）中平面结构农药的萃取效率[3]。随后，我们采用原始 AOAC 法（不含甲苯）和改进的AOAC 法（添加甲苯）相结合阐明了 Bond Elut QuEChERS AOAC试剂盒在菠菜中农药残留分析方面的性能[4, 5]。在这项研究中，采用 13 种农药评价了安捷伦 EN 缓冲萃取剂(部件号 5982 - 5650)和Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取试剂盒在高色素水果和蔬菜(部件号 5982-5321 和 5982-5356)分析中的性能。也验证了该方法的重现性和回收率也。表 1 是菠菜中各种农药的化学和法规信息。

实验部分药品和试剂所用试剂和溶剂均为高效液相纯级或分析纯级。甲醇和甲苯购自霍尼韦尔（美国，马斯基根）。乙腈(ACN)、二甲基亚砜(DMSO)、冰醋酸(HAc)购自 Sigma- Aldrich 公司（美国，密苏里州圣路易斯）。醋酸铵(NH4OAc)购自费舍尔化工(美国，新泽西，Fair Lawn)。甲酸(FA)购自 Fluka(德国，Sleinheim)。农药标准品和内标物（磷酸三苯酯，TPP）分别购自 Sigma- Aldrich 公司（美国密苏里州圣路易斯）、Chem Service 公司（美国宾夕法尼亚州西切斯特）、Ultra Scientific 公司（美国罗得岛州北金斯敦）或 AlfaAesar (美国，马萨诸塞州，Ward Hill)。溶液及标准品将 19.27 克 NH4OAc 粉末溶解在 250 mLMilli-Q 超纯水中，用 PH计监控，采用乙酸调溶液 PH 值到 5，得到 PH=5 的 1M 醋酸铵原液，并于 4 ºC 保存。将 200mL MeOH 与 800mL Milli-Q 超纯水混合，加入 5mL PH=5 的 1M 醋酸铵原液，混合均匀，得到MeOH/H2O=20：80、PH=5 的 5 mM 醋酸铵溶液。向 1L 乙腈中加入 5mLPH=5 的 1 M 醋酸铵原液，均匀混合后超声 5 min，即得5 mM 醋酸铵乙腈溶液。1%甲酸的乙腈溶液可通过 100 mL 乙腈与1 mL 甲酸混合均匀得到。标准品和内标物（IS）储备液(除多菌灵为 0.5 mg/ mL 外，其余均为 2.0 mg/ mL)分别用 MeOH，含 0.1 %甲酸溶液的乙腈或 DMSO配制，于-20 ºC 下低温储存。1、5、20 µg/mL 的三种 QC 加标溶液以乙腈和 0.1%甲酸溶液的水 1:1 混合作基质，现配现用。制备10 µg/mL 标准品的乙腈/水（含 0.1% FA）=1:1 的加标溶液，并通过适当稀释，用于获得空白基质加标标准曲线。以含 0.1%甲酸溶液的 1:1 乙腈/H2O 为溶剂，制备 15 µg/mL 的 TPP 加标溶液。

仪器和材料Agilent 1200 Series HPLC with Diode Array Detector (AgilentTechnologies Inc., CA, USA)配备二极管阵列检测器的 Agilent 1200 系列高效液相色谱系统（美国，加州，安捷伦科技有限公司）配置电喷雾离子源的 Agilent 6410 三重串联四级杆 LC / MS 系统（美国，加州，安捷伦科技有限公司）Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取试剂盒，部件号 5982-5650和用于高色素水果和蔬菜的 Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取试剂盒，部件号 5982 - 5321 和 5982- 5356（安捷伦科技有限公司，德州，美国)CentraCL3R 离心机（美国马萨诸塞州 Thermo IEC）瓶口移液器（美国新泽西州，So Painfield，VWR）Eppendorf 微型离心机（美国纽约，Westbury，Brinkmann 仪器公司）

仪器条件LC/MS/MS 法如前所述[9]液相色谱条件色谱柱： Agilent ZORBAX 溶剂节省 Plus Eclipse Plus苯基-己基柱，3.0 x 150 mm, 3.5 µm（部件号 959963-312)流速： 0.3 mL/min柱温： 30 ºC进样量： 10 µL流动相： A, PH=5 的 5 mM 乙酸铵 MeOH/H2O=20:80 溶液；B, PH=5 的 5mM 乙酸铵乙腈溶液洗针液： 1:1:1:1 乙腈/甲醇/异丙醇/水含 0.2%甲酸梯度： 流速时间 % 乙腈 (mL/min)0 20 0.30.5 20 0.38.0 100 0.310.0 100 0.313.0 停止后运行： 4 分钟总分析时间： 17 分钟质谱条件正离子模式气体温度： 350 ºC气体流速： 10 升/分雾化气： 40 Psi毛细管电压： 4000V分析物相关的其他条件列于表 2。

样品制备样品制备过程包括样品粉碎，萃取/分离和分散固相萃取净化等步骤，这在早期的应用指南上有详细的描述。[9]菠菜样品处理过程与苹果样品处理过程很相似，但与一般的水果和蔬菜样品处理相比，菠菜样品处理的分散固相萃试剂盒适用于高色素量产品分析。简单来说，首先将冻存的有机菠菜匀浆。取 10 克（±0.1 克）匀浆后的样品放入 50 毫升离心管中。如需要，可先通过适当的QC 加标溶液(100 µL)对样品进行加标，然后加入 66.7 µL IS 加标溶液（15 µg/mL 的 TPP）。涡旋 30 秒，每个样品管中加 10 mL 乙腈，盖紧样品管盖，振摇 1 分钟。每一个离心管中直接加入Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取盐包(部件号 5982-5650)及4 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠，0.5 g 柠檬酸氢钠半水合物。盖好管，用力振摇 1 分钟，于 4000 rpm 离心 5 分钟。1 mL 上层乙腈层转入安捷伦分散型固相萃取柱的 2 mL 管中（部件号 5982-5321）；或 6 mL 上清液转入安捷伦分散型固相萃取柱的 15 mL 管中（部件号 5982-5356 ）。2 mL 的管中含有 25 mgPSA，150 mg 无水硫酸镁和 7.5 mg GCB，而 15 mL 管中则含有150 mg PSA，900 mg 无水硫酸镁及 45 mg GCB。盖紧管，用力摇 1 分钟。将 2 mL 管 放入微 型离心 机中 13000 rpm 离心2 min，15 mL 管在标准离心机以 4000 rpm 离心 5 min。取 200 µL等份的萃取液转移到进样瓶中，立即加入 10 µL 1% 甲酸的乙腈溶液。然后加入 800 µL 水或者适量的标准品溶液（制备成水溶液）。盖紧样品管，涡旋混匀，以备 LC/MS/MS 分

结果与讨论QuEChERS 方法为农药残留分析提供了获得高质量结果的快速、简便而廉价的方法。对于含色素的水果和蔬菜，在分散型固相萃取管中添加石墨化碳黑（GCB）可以提高色素和甾醇的清除效率。清除效率与 GCB 的加入量有关。添加 GCB 的量越多，处理后的基质就会越干净，最终样品中的基质干扰就越少。由于 GCB 也可能导致萃取过程中的平面结构农药分子的清除，所以在 EN 分散固相萃取步骤中使用了非常少量的 GCB。与 AOAC 方法相比，用于色素性物质的 EN 方法在分散固相萃取步骤中使用了非常少量的 GCB。对于像胡萝卜、生菜这样的普通色素性商品，每毫升乙腈萃取剂中添加 2.5 mg 的 GCB；对于高色素性商品如菠菜和红甜椒，每毫升乙腈萃取剂中则需要添加 7.5 mg 的 GCB。[1]根据建议，我们研究中采用适用于高色素产品的 EN 分散萃取试剂盒。由于采用高色素试剂盒，EN 方法中的 GCB 用量仍然比AOAC 方法低得多，每 mL 乙腈萃取剂中只需添加 50 mg GCB。所以，很明显，EN 方法中的基质净化效率要比 AOAC 法弱得多。通过 EN 方法处理得到的样品仍然呈现深绿色，而先前经过AOAC 法处理后的样品几乎呈无色透明状。空白基质的紫外色谱（l= 254 nm）也有差异，如图 1 所示。EN 法处理的空白基质中干扰峰更多，而且更多的杂质在色谱柱或离子源处累积，可能对色谱柱及质谱仪造成不利影响。然而，由于 LC/MS/MS 提供了选择性，空白基质的 MRM 色谱图并没有显示任何目标分析物的干扰峰。图 2 显示了空白基质（添加内标物）和 50 ng/g 经过 EN 分散萃取法处理的加标菠菜萃取物的 LC/MS/MS 色谱图。4 种农药包括多菌灵、噻菌灵、嘧菌环胺和吡蚜酮，由于具有平面结构，在经过原来的 AOAC 分散固相萃取方法处理时明显损失。而在固相萃取步骤中，添加甲苯改进该方法可以提高萃取效率[3,4]。为了研究 GCB 对于平面结构农药的影响，我们比较了固相萃取步骤中分别添加和不添加甲苯时，对相同农药标准品（50ng/g）水平加标的菠菜样品萃取效果。结果表明，在 EN 法中GCB 的使用量比较少时，平面农药很少或没有损失，加入甲苯没有明显改善。因此，后续实验采用了原始的 EN 方法。也考察了该方法的回收率和重现性，还对定量结果进行了讨论。