使用LC/MS和 GC/Q-TOF技术强化土坛树树皮代谢物分析

摘要：传统草药被用作许多疾病的替代药物。土坛树就是这样一种传统药用植物。目前已有多项研究使用到这种植物的提取物，这也证明了其具有治疗价值。但是，极少有人尝试确定这种植物复杂的代谢物组成。在本应用简报中，我们用有机溶剂和水性溶剂对样品进行提取，对土坛树树皮上的代谢物进行分析和鉴定。通过 Agilent 1260 的分析型馏分收集系统对有机溶剂提取物和水提取物进行馏分收集。并利用 LC/MS 和 GC/Q-TOF 技术分析每种馏分。使用 HILIC 色谱和三个独立的正交反向色谱柱进行 LC/MS/MS 分析。使用 AJS 离子源在正离子和负离子模式下收集数据，然后在 METLIN 数据库或 MS/MS 谱库中进行搜索。那些未能获得数据库和谱库匹配的八角枫属化合物继而还可以使用安捷伦 MSC 软件在收录超过 3000 万个结构的 ChemSpider数据库中进行搜索。为了鉴定由 GC/Q-TOF 分析结果所产生的化合物，可以通过 AgilentFiehn GC/MS 代谢组学谱库和 Wiley/NIST 谱库对数据进行检索。借助多个 GC 谱库的搜索结果鉴定出 62 种化合物，匹配得分均大于 70。使用两种技术共检测出 1016 种化合物，其中有 511 种化合物被成功鉴定。文献检索显示，511 种化合物中有 81 种对癌症、微生物感染等传统疾病具有治疗效果。我们的研究表明，使用馏分收集法进行代谢物富集、用双相溶剂提取以及正交色谱柱固定相进行代谢物分离，并采用互补的 LC/MS 和 GC/MS 检测，可以提高药用植物的代谢物检测范围。

前言土坛树是印度阿育吠陀医学和中医学里的一种药用植物。这种植物通常用于治疗癌症、麻风病、糖尿病、瘫痪、微生物感染等多种疾病。植物的每个部分都可口服或者外用，具体取决于所治疗的疾病类型。此前已有实验将这种药用植物与特定疾病或效能建立起关联1,2。非靶向代谢组学的综合评估是指使用LC/MS、GC/MS 和 NMR 等互补的通用分析技术对所获样品中的生化中间体信息进行无偏见分析。影响代谢组综合评估的因素取决于：• 样品采集/提取程序中所用的方法• 分馏• 色谱分离固定相• 电离技术/模式• 采集参数• 数据处理/分析• 数据库/谱库鉴定5本研究使用正交 LC/MS 和 GC/Q-TOF技术对这种植物茎皮的代谢物进行综合分析，包括使用新的谱库和数据库鉴定代谢物。

实验部分工作流程表 1 概述了本研究所用的工作流程。

‍

试剂与材料LC/MS 级的异丙醇、甲醇和乙腈购自 Fluka 公司（德国）。使用 Milli Q 水（Millipore Elix 10 型，美国）进行流动相配制。添加剂（氟化铵、乙酸、甲酸铵、甲酸和乙酸铵）购自 Fluka 公司（德国）。

植物材料采集和提取程序从印度迈索尔附近的土坛树上采集土坛树树皮并将其立即转移至液氮中，储存在 -80 °C 的温度下备用。使用研钵和研杵将 2 g 树皮组织在液氮中研磨为粉末。加入 40 mL 氯仿:甲醇:水比例为 1:2.5:1 (v/v/v) 的脱气溶液，对树皮粉末进行提取。将未溶解的样品用研钵和研杵碾碎 5 min，随后将其转移至 1.5 mL Eppendorf 管中，在 4 °C 下涡旋混合 5 min。在 20800 rpm 的转速下将该管离心 2 min，将所有管中的上清液合并至一个玻璃样品瓶内。将 1 mL上清液转移至 Eppendorf 管中，加入400 μL 水。将该管涡旋混合 10 s，然后在 20800 rpm 的转速下离心 2 min。分离水层（上层）和有机层（下层），并分别置于 SpeedVac 浓缩器（Eppendorf 浓缩仪）中蒸干。

馏分收集向蒸干后的水层和有机溶剂层中加入200 μL 各自分馏法所使用的流动相 A和 B（体积比分别为 50:50 和 30:70）（表 2）。对样品瓶进行超声处理使化合物重新悬浮。将装有各种提取物的多个样品瓶的重悬混合物注入到配备 1 mL 手动 FL 进样阀（部件号 5067-4191）的 Agilent 1260 Infinity 分析型纯化系统中进行 HPLC 分离，将馏分收集在 96 孔板的 45 个孔中，然后用SpeedVac 浓缩器蒸干。

双重 AJS-ESI-Q-TOF MS 条件将蒸干后的水馏分重新悬浮于 250 μL50:50 甲醇:含 0.2% 乙酸的水溶液中，超声处理 10 s，将有机溶液馏分悬浮于 30:70 流动相 A:B（表 3 - 有机），然后在 3000 rpm 的转速下离心 10 min。然后，将 5 μL 重悬馏分注入与 Agilent6540 精确质量数 Q-TOF LC/MS 系统相连接的 Agilent 1260 Infinity LC 系统中。使用 API-TOF 参比质量溶液试剂盒（部件号 G1969-85001）制备参比溶液。将 10 μL HP921 和 5 μL 嘌呤溶解在 1 L 甲醇:乙腈:含 0.1% 乙酸的水(750:200:50) 溶液中，并使用等度泵在0.4 mL/min 的流速下进行雾化。质谱和色谱参数如表 3A 和 3B 所示。

结果与讨论在本应用简报中，我们使用多分离方案/电离模式和多平台方法对土坛树树皮代谢物进行了综合分析。最初，我们注入 1 mL 提取物进行水和有机溶剂提取物的馏分收集，以初步分离和富集代谢物。将精确质量数 MS 结果与 METLIN 数据库比对，初步发现 954 种化合物，其数据库匹配得分 > 90%。文献检索显示，954 种化合物中有 81 种具有治疗功效。这些治疗性化合物中大多数是次级代谢物，据报道这些次级代谢物具有抗癌和抗炎活性（图 1）。这些化合物属于各种植物次级代谢物，如萜类、黄酮类、皂苷类、生物碱类、糖苷类等。对所有馏分进行 AutoMSMS 分析，鉴定出449 种化合物。