三重四极杆气质联用系统优化食品分析

摘要：微型化样品前处理具有许多优势。较少的溶剂用量可以降低溶剂成本，减少 浪费。较少的样品量使其易于在实验室中取用、储存和处理。样品量的减少 可以节约样品前处理吸附剂的成本，大幅降低使用标记化合物作为内标的成 本。样品量较小时可以对复杂的分析物使用更多标记化合物，但如果样品量 较大，这样做会产生高昂成本。 我们使用微型化 QuEChERS 萃取和 Agilent 7010三重四极杆气质联用系统的超高 效离子源分析食品中的农药，可将进样量减少 75%。对苹果、胡萝卜和西兰 花中的 126 种农药进行了研究，其中 95% 农药的平均定量限 (LOQ) ~ 10 ng/g。 基质进样量低可延长正常运行时间，维持高性能，从而降低维护成本。我们 仅使用标准 2 µL 进样量的 25% 并采用推荐的农药分析方法，分析了浓度小 于等于 EPA、EU 和日本 MRL 阈值 0.01 mg/kg (10 ng/g) 的农药，此浓度适用于 监测暴露。

前言：用于农药分析的快速、简便、经济、高效、耐用和安全 (QuEChERS) 方法由 USDA 于 2003 年提出 [1]。后来这 种方法经过改进，加入缓冲萃取系统 [2]，可以分析较为 棘手的农药。AOAC 2007.01 [3] 和 EN 15662 [4] 中规范并采 纳了这两种改进方法。概括而言，这种方法采用单步缓 冲乙腈萃取，同时用硫酸mei (MgSO4) 从样品中盐析出水 以诱导液-液分配。净化采用分散式固相萃取法（分散式 SPE），同时使用吸附剂和 MgSO4。 我们分析了苹果、胡萝卜和西兰花，因为它们是美国农 业部 (USDA) 农产品销售局根据农药数据项目 (PDP) [5] 规 定的收获测试期间的农产品。EPA、EU 和日本均已制定 最大残留* (MRL)，此*是确定食品中农药最大允 许浓度的安全限值。这些 MRL 能够防止非法或过量使用 农药，从而保护消费者的身体健康与环境。因此，相关 机构会对可能影响消费者安全以及破坏环境的农药进行 持续监测，以确保产品的安全性和法规依从性 [6]。 许多食品的成分或加工方式使其变得非常复杂，这些食 品中可能存在大量的干扰化合物，导致背景干扰增加。 GC/MS/MS 经常用于对此类复杂基质中的痕量目标化合 物进行筛查、确认与定量分析。串联质谱可以实现选择 性离子对监测，因此可以消除或最大限度降低背景干扰。 QuEChERS 样品前处理方法从这些复杂基质中萃取化合 物，但不会*去除所有干扰基质。因此需要其他技术 辅助除去分析系统中的污染物。例如，气相色谱柱的反 吹功能可以确保基质中的高沸点化合物不会流经色谱柱， 减少色谱柱流失。反吹功能还可以消除鬼峰，将质谱仪 的污染降至低 [7,8]。改善离子源内离子化（超高效离 子化）等其他技术，可以在更低的进样量下保持对目标 分析物的高灵敏度。

QuEChERS 方法基于 10 或 15 g 的均质代表性食品样品。 改用较小样品量具有众多优势，表现在样品更便于处理、 溶剂和标记标样用量减少，以及需要的储存空间更少。 在本应用简报中，我们研究了按比例减量的 QuEChERS 萃取方法。样品、溶剂和盐可以按比例减少，同时保持 样品/溶剂/盐的比例与经过验证的 QuEChERS 方法中规 定的相同 [3,4]。因此，我们预期回收率或分析结果不会 受到负面影响。微型化 QuEChERS 方法与 Agilent 7010 三 重四极杆气质联用系统的超高效离子源相结合，可大大 减少达到推荐检测限 (LOD) 和减少基质效应所需的进样 量，并降低样品前处理成本。

实验部分 所有试剂和溶剂均为分析纯级或更高等级。乙腈 (ACN) 购自 Honeywell International, Inc. (Muskegon, MI, USA)，乙酸 购自 Sigma-Aldrich 公司 (St. Louis, MO, USA)。纯度 > 95% 的 L-古洛糖酸、g-内酯、L-古洛糖酸内酯和 D-山梨醇同样 购自 Sigma-Aldrich 公司。定制农药组合（15 种*混合 物）的 100 µg/mL 丙酮溶液购自 AccuStandard 公司 (New Haven, CT, USA)。磷酸三苯酯 (TPP)和 13C12- p,p-DDT 购自 Sigma-Aldrich 公司和 Cerilliant 公司 (Round Rock, TX)。 向 500 mL ACN 中加入 5 mL 乙酸 (HAc)，制成 1% 乙酸的 乙腈溶液。L-古洛糖酸内酯、D-山梨糖醇储备液以及分 析物保护剂的配制方法见“安捷伦 GC/MS/MS 农药残留 分析参考指南”第 87 页。请联系安捷伦客户服务中心索 取指南印刷本 [9]。 仪器 本研究使用 Agilent 7890 气相色谱联用带超高效离子源的 7010 三重四极杆质谱仪。气相色谱系统配备电子气路控 制 (EPC)、支持风冷的多模式进样口 (MMI)、Agilent 7693A 自动液体进样器，以及基于 Ultimate 吹扫接头（由 AUX EPC 模块控制）的反吹系统 [7,8]。使用 Agilent MassHunter 软件进行仪器控制以及定性和定量数据分析。

安捷伦惰性流路组件 色谱柱： Agilent J&W HP-5ms 超高惰性色谱柱, 5 m × 0.25 mm, 0.25 µm（部件号 G3903-61005）和 15 m × 0.25 mm, 0.25 µm（部件号 19091S-431UI） 衬管： 超高惰性浅凹坑衬管，2 mm（部件号 5190-2297） 密封垫圈： UltiMetal Plus 可塑金属密封垫圈（部件号 G3188- 27501），安装在用于色谱柱反吹的 Ultimate 吹扫接 头上 其他安捷伦备件 样品萃取： Agilent Bond Elut QuEChERS AOAC 萃取盐包（部件 号 5982-6755）；用于一般水果和蔬菜的 Bond Elut QuEChERS AOAC 分散式固相萃取试剂盒（部件号 5982-5022）以及用于深色素水果和蔬菜的 EN 分散 式固相萃取试剂盒（部件号 5982-5221） 均质子： 用于 15 mL 试管的 Bond Elut QuEChERS 陶瓷均质子 （部件号 5982-9312） 进样针： 手动进样针，10 µL（部件号 5190-1491）、25 µL （部件号 5190-1504）、100 µL（部件号 5190-1518）、 250 µL（部件号 5190-1525） 样品瓶： 自动进样器样品瓶（部件号 5182-0733） 样品瓶内插管： 自动进样器样品瓶内插管，脱活玻璃，平底（部件 号 5183-2086）

其他设备 • Robot Coupe 搅拌机 • VWR 涡旋振荡器 • Heraeus Labofuge 400 离心管 • Eppendorf 微量离心管 样品前处理 使用安捷伦萃取盐和分散试剂盒，根据 QuEChERS 方法 的 AOAC 版本 [3] 对水果和蔬菜萃取液进行前处理。将有 机培植的农产品切碎、冷冻，随后在 Robot Coupe 搅拌机 中利用干冰进行均质化。将均质样品储存于 –20 °C 下等 待萃取。 萃取/分离 称取 2 g 均质样品至 15 mL 离心管中，加入两粒陶瓷均 质子。向 QC 样品中加入 1 µg/mL 农药储备液（126 种农 药），得到浓度为 5、10 和 50 ng/g 的 QC 样品。除对 照空白外，向其余所有样品中加入 10 µL 内标加标溶液 （10 µg/mL d10、13C12-p,p-DDT 和 TPP），使每个样 品的浓度均为 50 ng/g。盖上离心管，涡旋混合 1 分钟。 向每个管中加入 2 mL 1% HAc 的 ACN 溶液。盖上离心管， 涡旋混合 1 分钟。然后向管中直接加入 1 g Bond ElutQuEChERS AOAC 盐（部件号 5982-6755）。将样品管盖紧， 用手剧烈振摇 1 分钟。最后将样品离心管在 4000 rpm 的 转速下离心 5 min。

分散式固相萃取净化 从萃取物中移取1 mL 上层ACN 相至2 mL Bond Elut QuEChERS 分散式固相萃取管中。对于苹果萃取液，使用含有 50 mg PSA 和 150 mg MgSO4 的 Bond Elut QuEChERS AOAC 分散式 固相萃取试剂盒。对于西兰花和胡萝卜萃取液，使用含 有 25 mg PSA、2.5 mg GCB 和 150 mg MgSO4 的 Bond Elut QuEChERS EN 分散式固相萃取试剂盒。将管盖紧，涡旋 混合 1 分钟，然后在微量离心管中以 13000 rpm 的速率离 心 3 分钟。移取 250 µL 萃取液至 2 mL 自动进样器样品瓶 的 400 µL 脱活玻璃平底内插管中。再向内插管加入 50 µL 1% HAc 的 ACN 溶液（如为萃取后加标，则加入该混合 溶液）和 10 µL AP（分析物保护剂）[9]。图 1 展示了微 型化 QuEChERS 样品萃取步骤的工作流程。

仪器条件 气相色谱条件 色谱柱 1： Agilent J&W HP-5ms UI, 5 m × 250 µm, 0.25 µm， 连接 MMI 和辅助 EPC 色谱柱 2： Agilent J&W HP-5ms UI, 15 m x 250 µm, 0.25 µm， 连接辅助 EPC 和真空系统 载气： 氦气 进样模式： 溶剂排空 进样量： 0.5 µL（进样针规格 5 µL) 溶剂清洗： 进样前，1x 溶剂 A，甲醇:水 (4 µL)，1x 溶剂 B， 乙腈 (4 µL) 进样后，7x 溶剂 A，甲醇:水，7x 溶剂 B， 乙腈（每次 4 µL） 样品抽取次数： 5 进样速度： 快速 MMI 柱温程序： 60 °C 保持 0.35 min，以 900 °C/min 升至 280 °C （保持 18 min），然后以 900 °C/min 升至 300 °C， 直到分析结束 分流出口吹扫流速： 50 mL/min，自 1.5 min 处开始 排空流速： 25 mL/min 排空压力： 5 psi 持续 0.3 min 载气节省： 关闭 隔垫吹扫流速： 3 mL/min 空气冷却（低温）： 在 125 °C 处开启（在 GC 中选择 MMI 液氮选项 以进行风冷） 柱温程序： 60 °C 保持 1.5 min，以 50 °C/min 升至 160 °C， 以 8 °C/min 升至 240 °C，以 50 °C/min 升至 280 °C（保持 2.5 min），以 100 °C/min 升至 290 °C（保持 1.6 min） 柱 1 流速程序： 0.897 mL/min 保持 15.2 min，从 100 mL/min 至 -1.706 mL/min（与色谱柱 2 的流量平衡， 以达到 2 psi 的进样口压力），直到分析结束， 进行色谱柱并行反吹，后运行 -10.683 mL/min 柱 2 流速程序： 0.997 mL/min 直到分析结束， 后运行 4 mL/min 保留时间锁定： 甲基毒死蜱锁定于 8.524 min 总运行时间： 18.5 min 后运行： 290 °C，0.5 min 质谱条件 质谱离子源： -70 eV 离子源温度： 280 °C 四极杆温度： 150 °C 传输线温度： 280 °C 溶剂延迟： 4.0 min 氦气淬灭气： 2.25 mL/min 氮气碰撞气： 1.5 mL/min 采集模式： 多反应监测 (MRM) MS1/MS2 分辨率： 宽 时间段： 参考文献 [9] 第 94 页 采集参数： 参考文献 [9] 第 95-105 页

结果与讨论：准确校准 本研究使用苹果、胡萝卜和西兰花评估此方法在常规分 析中的使用。根据不同基质选择特定的分散式固相萃取 试剂盒；苹果使用 PSA，胡萝卜和西兰花使用 PSA 和 2.5 mg GCB。图 2 显示了 126 种农药（浓度 10 ng/g）加标 西兰花基质萃取物的代表性叠加谱图。在空白基质（苹 果、胡萝卜和西兰花）萃取液中加入 1、5、10、20、 50 和 100 ng/g 的农药，制得含有 126 种农药和农药异构 体混合物的校准标样。将这六个标样的组合连续进样六 次，取六次的中位值绘制校准曲线，采用 1/x 加权进行 线性拟合。将其他五组标样用作 QC 样品，在图 3 中显 示为蓝色三角形，用于指示方法的精密度。根据校准曲 线中每个浓度的含量计算值确定 RSD 百分比 (n = 6)。在 所有基质中加入的 126 种农药中，95% 农药校准数据组 的相关系数 (R2) > 0.99。每进样一组六个浓度的校准标样 后，进样一个溶剂空白。这些样品中监测到的棘手化合 物如图 3 所示。 进样量为 0.5 µL 时，5 ng/g 标样中的分析物含量为 2.5 pg， 进样量为 2 µL 时这一含量为 10 pg。样品量减少了 75%。 即使进样有所减少，某些最棘手农药仍在默认 MRL 的一 半或 5 ng/g 处得到最佳色谱图。