海鲜组织中的兽药分析-液相色谱与液质联用

前言：水产养殖是一个不断增长的全球性行业；预计 2030 年以后全球产量可能超过 93000 吨1 。随着产量提高而不断增加的兽药使用量已成为全球关注的问题。虽然 针对水产养殖用兽药和非处方抗生素的使用有相应的控制和监管措施，但某些国家 对耐药性和毒性的担忧仍在不断增加。美国食品进口量持续增长，因而愈发需要一 种快速灵敏的筛查技术，用于检测海鲜中未经批准的水产养殖用兽药。多家制造商 已经开发出使用酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 来测定兽药残留的快速筛查方案。性 能最佳、灵敏度最高的仪器方法当选高效液相色谱 (HPLC) 与串联质谱（MS/MS 或三重四极杆/MS）联用系统，该仪器平台可显著降低背景信号，还能够准确定量 测定样品基质中浓度极低的兽药2 。 另一方面，Ionsense, Inc. 的实时直接分析质谱 (DART-MS) 有利于对组织制品中的各 类兽药进行实时实验室分析，同时省去了典型 HPLC-MS 所需的标准方案和程序。 通常采用费时的 ELISA 试剂盒分析个别的目标兽药，借助 DART-MS 进行分析可以实 时、同步地检测多种兽药类别。

开发如 DART-MS 的离子源技术，以便在 大气压/地电位（分子电离至带电状态所 消耗的能量）对材料和样品基质进行 快速、非接触分析。将挥发性样品引入到 一个真空源中，在那里与亚稳态原子相反 应而发生电离。该技术诞生于 2005 年， 首先在州和联邦实验室中用于筛查人用非 法药物，并且已通过 HPLC-MS 技术验证 为确证性方法。它已经有一些成功应用 的示例，包括药物、代谢物、肽和低聚 糖、合成有机物、有机金属化合物、滥用 药、爆炸物和有毒工业化学品等的检测。 DART-MS 当前用于混凝土、沥青、人体 皮肤、货币、航空公司登机牌、名片、水 果、蔬菜、香料、饮料、体液、园艺树 叶、鸡尾酒杯和服装等各种表面，它可以 实时地提供瞬间响应，这对于提高通量和 增强分析能力至关重要3 。 三重四极杆MS 技术已得到成功应 用。它以 Agilent iFunnel 技术的高性能为 基础，其中包括 Agilent 6495 三重四极杆 液质联用系统，该系统能够检测极低浓度 的兽药。6495 系统将分析灵敏度、动态 范围、耐用性、精密度和准确度提升至水平4 。本应用简报介绍了安捷伦技术 iFunnel 与 DART 离子源 的实时分析能力结合的新用途，即，对添 加兽药混标至海鲜组织中的虾和鱼类海鲜 基质进行分析。

使用 Agilent 6400 系列三重四极杆/MS， 以全面考察 DART 和 HPLC-ESI（电喷雾 离子化）的功能，这是通过 Agilent 1290 HPLC-6495 系统和 DART-6495 系统并行 地分析一系列兽药来实现（图 1）。

实验部分 使用 Agilent 6495 iFunnel（三重四极杆 质谱仪，型号 G6495A）和 Ionsense, Inc. 带 Vapur 接口的 SVP-DART 对分析物进行 分离。分析九种兽药的混合标样（图 2， Sigma-Aldrich），测定 平台对 这些组分的定量限、检测限、线性动态范 围和分析灵敏度等基准资料。

采用 Agilent Bond Elut 增强型脂质去除产品 (EMR―Lipid) 萃取鱼虾组织。EMR―Lipid dSPE 试剂盒包括分散吸附剂，其被预称 量置于 15 mL 离心管中（EMR―Lipid，部 件号 5982-1010），还包括经过预包装的 MgSO4 抛光粉（部件号 5982-0102）。 将大约 15 g 的白虾 (l. setiferus) 和 5 g 罗 非鱼 (Oreochromis spp) 转移至陶瓷研 钵中，将其*浸软以裂解组织的细胞 壁。将 2 g 浸软的组织转移至 50 mL 聚 丙烯离心管中。在水中制备各个加标化 合物之后（例外：氯霉素使用购自 Fisher Chemical 的 LC/MS 级乙醇进行配置）， 使用去离子水为图 2 中列出的 9 种药物 配置混合加标溶液。该混合溶液的加标 浓度为：500 ppb、250 ppb、100 ppb、 50 ppb 和 10 ppb。 组织加标后，静置样品 15 分钟。接着， 将加标组织涡旋混合 30 秒，然后将 10 mL 含 5% 甲酸的乙腈溶液（Fisher Chemical， LC/MS 级）加入离心管中。将离心管涡旋 混合 1 分钟，并在 4000 rpm 的转速下离 心 10 分钟。离心后，另将 5 mL 的 5 mM 乙酸铵加到已预装分散固相萃取剂的 15 mL 聚丙烯管（部件号 5982-1010）中 涡旋混合 1 分钟，活化 EMR―Lipid 分散 吸附剂。也可以在后续实验中使用 18Ω 纯水，得到更出色的结果。在分散步骤中 用纯水替代乙酸铵的方案将在随后的文章 中发布。

涡旋混合分散吸附剂和乙酸铵后，立即将 所提取样品管中的 5 mL 上清液加到包含 分散吸附剂和乙酸铵的离心管中，涡旋 混合 1 分钟，并在 4000 rpm 的转速下离 心 10 分钟。然后将全部萃取液从 EMR― Lipid 离心管中倾析到一个 50 mL 离心管 中，并加入一整袋 MgSO4 抛光粉。先摇 晃该离心管，再涡旋混合 1 分钟，并在 4000 rpm 的转速下离心 10 分钟。然后 将包含 MgSO4 粉末的离心管上层转移到 干净的 15 mL 聚丙烯管中，并在 65±5 °C 的水浴上使用 N2 进行吹扫蒸发，直至管 中留有 10 μL 内容物。

将 15 mL 聚丙烯管中的内容物复溶于 100 µL 1:1 的 5 mM 甲酸铵/甲醇（Fisher Chemical，LC/MS 级）中。将管中复溶物 涡旋混合 30 秒。DART QuickStrip 卡的每 个筛查点上用 5 μL 溶液进行点样。要完 成 HPLC 分析，将 50 µL 复溶溶液转移至 2 mL 微量离心管中离心 30 秒。随后，将 30 µL 离心后溶液转移至带有聚合物内插 管（部件号 5180-1270）的安捷伦 HPLC 样品瓶中。图 3 展示了 Agilent Bond Elut EMR―Lipid dSPE 的流程图。图 4 以图形 方式展示了 Bond Elut 增强型基质去除试 剂盒增强的净化效果。

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结果与讨论 要校正样品的基质干扰效应，可通过分析 虾和鱼组织与基质匹配的混合标样（使用 兽药标样加标的组织样品），确定所检组 织中兽药的检测限。根据第二次分析的 DART 结果（图 6），所有与基质匹配的 兽药标样在浓度为 50 ppb 时均可检出， 且若干与基质匹配的兽药还可在浓度低至 1 ppb 时检出。图 11 和 12 展示了使用浓 度为 1 ppb 的基质匹配标样得到的环丙沙 星和氟甲喹的 数据结果。 要校正样品基质干扰效应，可使用方案分析中的与基质匹配 的混合标样，确定所检组织中兽药的检测 限。如恩诺沙星示例所示（图 13），基质 匹配标样浓度为 10 ppt 时，其中的目标 分析物可轻松检出。