利用*的高效率、低能量电子电离方法测量海洋呼吸

我们提出了一种新的低能量 EI 方法来更好地了解乙醇 酸盐的昼夜循环。乙醇酸盐是一种可为海洋微生物循 环提供动力的代谢物。乙醇酸盐是一种光呼吸废产物， 可作为异养微生物的碳源和能量源。1 现有的乙醇酸 盐海洋浓度测量方案一直受到回收率低、分析误差大 以及色谱干扰的限制。2 我们提出应用新型高效 EI 离 子源实现对环境相关浓度下微生物代谢物测量的高灵 敏度分析，同时减少化学干扰。此外，使用标准化代 谢工作流程可更好地覆盖已知的生物学通路，并更深 入地了解海洋微生物群落代谢的复杂性。 乙醇酸盐在海水中的浓度范围为 1 nmol/L– 100 nmol/L (10-9 mol/L)。 3 虽然这一浓度水平本身不 难检测，但已有研究表明海水基质是小分子极性代谢 物（如乙醇酸盐）分析的一大干扰。4

标样和基质空白的配制 用合成海水 (Ricca Chemical Company) 配制标样和溶 媒空白，合成海水中仅含海水中常见的盐和痕量矿物 质。用乙酸乙酯配制浓度为 1 mmol/L 的乙醇酸盐储 备液。所有试剂均购自 Sigma Aldrich。 天然样品的采集和前处理 天然海水样品采集自墨西哥湾（珀迪多基和坦帕湾）。 将沿岸带的样品装在聚对苯二甲酸乙二醇酯瓶中，并 在 4 °C 下保存。理想情况下，样品将置于干冰上冷冻 运输，并在分析之前保持冷冻以减少酶促过程。后续 样品均通过这种方式进行处理。

乙醇酸盐的提取和浓缩 将每个海洋样品等量取 10 mL，装入 20 mL 顶空样品 瓶。向每个样品顶空瓶中加入内标。用 2 mL 1 mol/L HCl 进行酸化，使 pH 远低于乙醇酸的 pKa。用乙酸 乙酯提取两次，合并有机馏分。然后加入碱提高 pH 并形成甘醇酸铵。将游离酸转化为盐形式可减小蒸发 损失的可能性。室温下用氮气蒸发器吹干。用乙酸乙 酯将样品转移至 2 mL 样品瓶中（每次使用 500 µL 乙 酸乙酯，共 3 次），并再次吹干。 虽然对乙醇酸盐的分析来说并不需要，但我们希望通 过匹配 Fiehn 衍生化方案让方法具有通用性。5 这使我 们能够应用通用的分析方法并鉴定其他小分子极性代 谢物（如丙酮酸盐）。因此，我们采用甲氧基胺盐酸 盐使酮肟化。然后用 MSTFA (1% TMCS) 衍生化以形 成甲硅烷基衍生物。最终体积为 100 µL，这意味着浓 缩系数为 100 倍。

仪器分析 本研究采用配备芯片式保护柱和盘式色谱柱技术的 Intuvo 气相色谱仪。芯片式保护柱实际上是一个 0.7 m × 0.53 mm 内径的去活化通道，能够捕获污染物， 以免其进入分析柱造成污染。芯片式保护柱可独立于 进样口进行加热，并可用于捕获后洗脱的化合物，或 用作进样口的延伸部分。本研究中，由于无需进一步 优化，我们将其用作进样口的延伸部分。

本研究还使用了 5977B GC/MSD 所提供的新一代高 效电子电离 (EI) 离子源。在标准离子源条件下，该离 子源产生的离子通量通常比传统离子源高 30 倍。这是 由于它采用创新的方式产生和传输电子，因此能够以 比传统离子源更低的发射电压和电子能量运行。这种 操作模式能够保持相对较高的离子通量，同时减少碎 裂并生成更多分子量更高的碎片。

LLOQ 为 1 nmol/L，有效浓度为 100 nmol/L。将其转 换为柱上分析物时，大约为 1 pg。因此，真正的困难 并非检测乙醇酸盐，而是减小基质干扰。两种简单的 方法可通过离子源优化来进一步减少样品量和/或减少 碎裂。例如，可通过将离子源温度降至 200 °C，将电 子电压降至 30 eV，并将发射电流减小至 20 mA，从 而减少碎裂。

如实验部分末尾所述，快速调整离子源参数能够减少 碎裂。从图 3 可以看出，低质量数碎裂减少。然而， 为检测 220 Da 处的伪分子离子或显著改善用于定量 分析的 M-15（甲基丢失）碎片离子的响应，需要进 一步优化（包括优化增益设置）。 一种更简单的方法是使用高离子通量来进一步减少初 始样品量或增加分流比。

结果与讨论：

乙醇酸盐在海洋代谢中的营养作用 在生氧光合作用期间，将发生二磷酸核酮糖的化而非 羧化。虽然大多数光合生物采用一条或多条途径来挽回 一部分损失，但是寡营养的亚热带环流中丰富的初级 生产者原绿球藻 (Prochlorococcus) 已通过基因组精简 失去了这条途径，或者可能由其异养对应物种实现补救 作用。相反，将排出光呼吸生成的乙醇酸盐。随后，这 些乙醇酸盐被异养微生物消耗。多个昼夜循环中测得的 天然海水样品中均匀标记的 14C-乙醇酸盐同化和呼吸的 动力学表明，异养微生物能够快速消耗该化合物。6 乙 醇酸盐吸收及随后的同化和呼吸的动力学依赖于光和日 间时长，虽然在昼夜循环中也发生生理变化，但是无法 与环境浓度区分开来。 过往的方法依赖于大样品量，并将其浓缩一千倍或更多。 为了消除干扰同时获得合理的目标分析物回收率，样品 前处理方法非常复杂。仪器的新发展为我们提供了两 种新技术，使我们能够减少基质干扰并提高仪器的分析 灵敏度。我们的目标是建立碳交换量的范围，并增加对 海洋环境中光合作用与呼吸作用相互耦合的理解。

将该方法应用于代谢流 如同光呼吸一样，代谢任务的分配在海洋微生物群落中 似乎非常普遍。然而，我们对这些分工的怀疑大部分是 粗略的，其依据是互补途径的分子证据，而并非直接观 察得到结果。这一较大的知识缺口主要是由于难以定量 分析这些途径中的细胞外“中间体” 。 目前正在开发寡营养海洋微生物群落中丰富的代表性 生物的详细代谢流模型，旨在解析这些互补途径。这种 新的分析方法使我们能够定量分析细胞外代谢物的动态， 特别是小分子有机酸、核苷酸和糖，这些物质被认为可 调节微生物群落的相互作用。这些交换的代谢物的时间 分辨定量将为电脑模拟微生物群落提供流平衡限定参数。

我们的长远目标是开发一种多组学方法，包括对栽培和天 然微生物群落的测量，以开发针对海洋呼吸的代谢流模型。 乙醇酸盐的定量分析是开发准确模型的关键步骤。当前的 工作展示了以下几个步骤： • 我们能够使用经典的 Fiehn 代谢组学方法定量分析乙醇 酸盐 • 我们成功地将 Fiehn 方法与一种新型气相色谱仪结合使 用，该色谱仪将直接色谱柱加热的速度与用于捕获干扰 基质的集成芯片式保护柱相结合 • 还采用了一种新型高效 EI 离子源，将离子通量提高了 20–30 倍。这使我们获得了乙醇酸盐的强信号响应，而 传统方法对这一低 nmol/L 浓度范围的分析非常困难 我们计划将此项研究获得的见解应用于其他传统上难以分 析但是在代谢中非常重要的有机酸。