使用Captiva 和 LC/MS/MS 分析婴儿配方奶中的真菌毒素

摘要：多个国家规定了食品中真菌毒素的含量限值。然而，某些食品中含有复杂的蛋白质 和脂质，为准确定量分析这些基质中的低浓度真菌毒素带来了很大的挑战。本应用 简报介绍了采用快速、简便、经济、高效、耐用和安全 (QuEChERS) 的工作流程和 Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱净化测定固态和液态婴儿配方奶中的 13 种真菌毒 素。由于 Captiva EMR-Lipid 吸附剂的高选择性，所有真菌毒素均获得了出色的回收 率 (70.4%–106.8%) 和精密度 (RSD < 18%)。这一简单而稳定的方法仅需极少设备和 专业技术，因此可轻松应用于食品实验室。

前言：真菌毒素是谷物、玉米和坚果等多种农作物上真菌物种的次级 代谢物。当奶牛食用了受污染的饲料后，真菌毒素及其代谢 物会分泌到牛奶中1 。黄曲霉毒素 M1 是牛奶中最常见的真菌 毒素，许多国家/地区都对其进行了监测和监管，包括美国和 欧洲国家2,3。尽管还没有针对牛奶中其他真菌毒素的法规，但 对其他真菌毒素（如伏马菌素和赭曲霉毒素）的监测也日渐 增多。 由于法规限值非常低，尤其是在婴儿配方奶中，因此，为去除 基质干扰以增强低浓度分析物的信号，样品前处理不可少。 免疫分析或 LC/MS 方法，结合样品前处理技术（如免疫亲 和、固相萃取 (SPE) 或稳定同位素稀释4 ）可用于分析真菌毒 素。但是，复杂的多脂样品由于基质组分（如蛋白质和脂质） 浓度较高，其分析尤为棘手。免疫亲和柱价格昂贵，且只能用 于特定的分析物、化合物类别或样品类型。其他净化产品可能 缺乏对目标分析物的选择性，无法有效去除脂质，从而导致分 析重现性差、基质效应明显，并使基质在仪器中聚集。 Agilent Captiva EMR-Lipid 是一款脂质去除产品，结合了体积 排阻与疏水相互作用两种净化机制，能够选择性地捕获脂类 烃链，同时不损失目标分析物。Captiva EMR-Lipid 净化管现 有 3 mL 和 6 mL 两种体积，可提供一种简单的流通式净化， 能够从多脂样品萃取物中选择性地去除脂质，适用于多类别、 多残留分析。使用 QuEChERS 萃取从液态婴儿配方奶和婴儿 配方奶粉中萃取 13 种真菌毒素。QuEChERS 方法因其能够高 效萃取多个类别的分析物而著称，但该方法同时也会萃取出大 量基质。Captiva EMR-Lipid 过滤柱具有高脂质去除率，有助 于分析人员准确定量目标真菌毒素。此外，通过分析婴儿配方 奶样品中三种加标浓度下的黄曲霉毒素（AF-B1、B2、G1、 G2 和 M1）、赭曲霉毒素（OTA 和 OTB）、伏马菌素（FB1、 FB2 和 FB3）、玉米赤霉烯酮 (ZON)、霉酚酸 (MPA) 和杂色曲 霉素 (STC) 对该方法进行了验证。对于这类复杂脂肪基质中痕 量真菌毒素的分析，该方法表现出了优异的回收率、精密度和 灵敏度。

实验部分 样品前处理 • Captiva EMR-Lipid 3 mL 净化管（部件号 5190-1003） • Captiva EMR-Lipid 6 mL 净化管（部件号 5190-1004） • QuEChERS Original 萃取盐（部件号 5982-5555） • VacElut SPS 24 位真空萃取装置（部件号 12234022）

化学品与试剂 从当地杂货店购买食品样品用于方法定量和基质去除研究。标 准品和内标以预混合溶液的形式购自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 或 Romer Labs (Getzersdorf, Austria)。LC 溶剂购自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。 验证研究 通过分批分析验证婴儿配方奶中的真菌毒素，包括两个双空白 样品、两个空白样品、六个校准品和三种 QC 浓度。QC 样品 的预加标浓度如表 1 所示，每个样品重复六次 (n = 6)，并在 两组校准曲线之间进样。使用六种浓度的校准品绘制校准曲 线，如下所示： • 对于 AF-B1、AF-B2、AF-G1、AF-G2、MPA、OTA、STC 和 ZON，采用 0.25、1、5、10、20、40 ng/mL • 对于 AF-M1 和 OTB，采用 0.125、0.5、2.5、5、10、 20 ng/mL • 对于 FB1、FB2 和 FB3，采用 1.25、5、25、50、100、 200 ng/mL 同位素标记内标 13C17-AF-B1 的加标浓度为 5 ng/mL。

样品前处理的详细步骤 对于婴儿配方奶粉 (5 g)，向校准品和 QC 样品中预加标适当 浓度的目标分析物，萃取之前，使其*浸入至少 1 小时。 接下来加入 10 mL 水，使其浸入样品中。对于液态婴儿配方 奶，使用 10 g 样品进行萃取，并相应地对校准品和 QC 样品 预加标，无需再加水。对于婴儿配方奶粉和液态婴儿配方奶， 加入 10 mL 乙腈（含 2% 甲酸）和 QuEChERS 萃取盐（4 g MgSO4，1.5 g NaCl），在 Geno/Grinder 上垂直振荡 10 分钟以 萃取样品。然后在 5000 rpm 下离心 5 分钟。移取上层乙腈相 (8 mL) 至洁净的 15 mL 试管中，加入 2 mL 水进行稀释（水 的体积百分比为 20%）并涡旋混合。将萃取物 (2.5 mL) 上样 到 3 mL Captiva EMR-Lipid 净化管，使其在重力作用下流过净 化管。待萃取物*从 Captiva EMR-Lipid 净化管中洗脱之后 （约 10 分钟），施加真空，将真空度从 1 增加到 10 英寸汞柱 以排空净化管。对于预加标样品，将 0.500 mL 洗脱液转移到 自动进样器管中，加入 0.300 mL 含 0.1% 甲酸的 5 mmol/L 甲 酸铵。将 0.500 mL 空白洗脱液转移至自动进样器管中，加入 0.270 mL 含 0.1% 甲酸的 5 mmol/L 甲酸铵和 0.030 mL 适当 的工作标准溶液，来配制基质匹配的校准物。

结果与讨论 线性 使用 Agilent MassHunter 定量分析软件处理数据。使用线性回 归拟合和 1/x2 加权得到 13 种真菌毒素的校准曲线，其 R2 值均 在 0.992–0.998 之间。所有校准品的准确度都在预期值 ±10% 以内。 准确度和精密度结果 本研究获得了出色的结果，结果汇总如表 2 所示。所有 QC 样 品的回收率都在 70%–120% 范围内，所有浓度下的 %RSD 均 小于 20，其中大多数分析物的 %RSD 小于 10。由于乙腈对伏 马菌素的萃取能力较差，伏马菌素成为了本研究中一类具 有挑战性的真菌毒素。优化实验表明，加入 2% 甲酸可大幅提 高该类分析物的溶解度，且不会对其他类别的分析物产生不利 影响。 EMR-Lipid 机制 EMR-Lipid 的选择性得益于体积排阻和疏水相互作用两种机制 的结合。脂类具有线性、无支链的烃链，其分子足够小，可以 进入 EMR-Lipid 吸附剂中。一旦进入吸附剂中，脂类就会因疏 水相互作用而被牢牢捕获。大多数分析物都不含线性、无支链 的烃链结构，因此不会进入吸附剂中，而是留在溶液中以待分 析。较短的烃链（少于六个碳原子）与 EMR-Lipid 的结合不够 强，因此无法像烃链较长的脂类那样得到有效去除。EMR-Lipid *的净化机制以基质干扰物而不是各种类别的分析物为捕集 目标，非常适用于多类别、多残留分析。

竞争产品比较 ― 回收率和精密度 对 Captiva EMR-Lipid（6 mL 小柱）和市售直通式净化产品 （竞争产品 A，6 mL，500 mg）的回收率和精密度进行评估。 在此次评估过程中，直接对婴儿配方奶萃取物进行加标，以排 除萃取过程对回收率和精密度的影响。表 3 中汇总的评估结果 表明，使用 Captiva EMR-Lipid 的回收率更高，尤其是对于玉 米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A 和杂色曲霉素。Captiva EMR-Lipid *的吸附剂化学机制能够选择性地捕获脂质，而目前的市售 产品往往会将不需要的分析物保留下来（尤其是具有较强疏水 性的分析物）。 使用气质联用仪GC/MS监测基质去除率 尽管已经使用 LC/MS 完成了验证，但通过比较样品净化产物 的 GC/MS 全扫描结果仍可获取有关基质和脂质去除情况的重 要信息。图 1 所示为婴儿配方奶在 Captiva EMR-Lipid 净化前 后的 GC/MS 全扫描色谱图。黑线为未净化样品的色谱图，表 明存在脂质及其他基质共萃取物。Captiva EMR-Lipid 净化后 的液态婴儿配方奶（紫线）的去除率为 90%（根据公式 1 计 算得到）。晚洗脱基质被*去除，早洗脱基质显著减少但未 *去除。

结论 本研究证明 Captiva EMR-Lipid 是一种简便有效的净化方法， 适用于多种真菌毒素的分析。婴儿配方奶的验证结果表明方法 具有优异的回收率（70.4%–106.8%）和精密度 (RSD < 18%)， 且灵敏度可达 1.0 ng/g。GC/MS 全扫描结果表明该方法可实 现高效净化。产品比较结果表明，使用 Captiva EMR-Lipid 的 真菌毒素回收率远优于其他市售净化产品。该方法在多种应用 中都具有较高的基质脂质去除率以及分析物回收率，但其中一 些应用不在本研究的范围之内5,6。Captiva EMR-Lipid 代表了用 于多类别、多残留分析的新一代选择性脂质净化产品，对于需 要简化样品前处理并改善方法性能的实验室而言，该产品是理 想之选。