测定三文鱼和牛肉中的 19 种多环芳烃化合物

摘要：本应用简报介绍了用于分析三文鱼和牛肉中的多环芳烃 (PAH) 残留物的多残留方 法的开发与验证。该方法使用液相萃取以及 Agilent Captiva EMR-Lipid 净化，并通过GC/MS/MS进行分析。使用固/液萃取 (SoLE) 对三文鱼或牛肉样品进行萃取，再 通过 Captiva EMR-Lipid 净化。然后使用异辛烷对净化的样品洗脱液进行反萃取， 以在 GC/MS/MS 分析之前去除水。在两步法 SoLE 中使用乙酸乙酯和乙腈的混合 物，改善了脂质食品基质中 PAH 的萃取效率。Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱能 够实现对样品基质的高效选择性净化，并采用三文鱼和牛肉样品对开发的方法进行 了验证。结果表明，所有检测的 PAH 化合物均获得了满足欧盟委员会规定（回收率 50%–120%）的可接受的回收率结果，RSD 低于 20%，且三文鱼和牛肉样品中浓度 为 1–500 ng/g 的分析物的校准曲线 R2 高于 0.99。通过重量法测得，三文鱼和牛肉 样品中基质共萃取残留物的去除效率分别为 60% 和 92%。

前言：PAH 是一类普遍存在的有毒化合物，其 特征是具有热力学稳定的稠合芳香环结 构。这些化合物天然存在于原油和煤中， 也可以于食品的加工过程中形成。PAH 化合物可根据稠合芳香环的数量进行分 类，例如分为轻 PAH（具有 2–3 个环） 和重 PAH（具有 4–6 个环）。重 PAH 比 轻 PAH 更稳定且毒性更高。由于它们具 有疑似或经证实的致突变性或致癌性，这 些化合物已经得到广泛研究和监管。美 国食品药品监督管理局 (FDA) 要求对海鲜 中低 ppb 级的 PAH 进行分析1 。欧盟委员 会 (EC) 规定了四种重 PAH 化合物（苯并 (a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽和䓛）的 分析方法标准，要求每种 PAH 的定量限 (LOQ) 达到 0.9 µg/kg 且检测限 (LOD) 达 到 0.3 µg/kg2 。 PAH 为强亲脂性化合物，容易在鱼、 肉、油和牛奶等脂质食品中发生生物累 积。脂质食品基质中 PAH 的分析所面临 的主要挑战，是将目标分析物与食品基质 中存在的大量脂质化合物分离。这一挑战 包括从脂肪基质中高效提取 PAH，然后 选择性去除不需要的脂肪基质共萃取物。 常用的样品前处理技术包括索氏提取3 、 超声辅助固/液萃取4 、加压溶剂萃取5 和 QuEChERS 萃取6 。这些技术可以与固相 萃取7 (SPE) 或凝胶渗透色谱8 等净化步骤 配合使用。

安捷伦增强型脂质去除 (EMR-Lipid) dSPE 净化产品自 2015 年推出以来就备受关 注。EMR-Lipid dSPE 吸附剂与脂类的无 支链烃链发生选择性相互作用，在溶液中 留下大量目标分析物以供后续分析。这一 选择性相互作用使其成为脂质食品基质中 多类别多残留分析的理想选择。与传统的 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid (50%) 相 比，Captiva EMR-Lipid 过滤柱只需更少 的水进行吸附剂活化 (20%)。这一变化简 化了工作流程，并改善了疏水性化合物在 净化过程中的回收率9 。本研究考察了使用 Captiva EMR-Lipid 过 滤柱流通式净化进行样品前处理，并通过 GC/MS/MS 分析三文鱼和牛肉中的 19 种 PAH 化合物。开发此方法的目的在于， 改善先前使用 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid dSPE 净化测定食品中 PAH 的 方法的局限性10。表 1 显示了所检测的农 药的分类、Log P 值、保留时间和 MS/MS 离子对。

实验部分 化学品与试剂 PAH 和内标来自 Ultra-Scientific (North Kingstown, RI, USA) 或安捷伦。HPLC 级 乙腈 (ACN)、丙酮和乙酸乙酯 (EtOAc) 购 自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。试 剂级异辛烷购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。 溶液与标准品 用丙酮配制两种浓度分别为 2000 µg/mL 和 500 µg/mL 的 PAH 储备液。用丙酮 由储备液制得浓度为 4 µg/mL 的工作 溶液。然后每天用丙酮新鲜配制浓度为 1 µg/mL 的加标溶液以用于样品加标。用 丙酮配制包含五种浓度为 20 µg/mL 的内 标化合物的内标工作溶液。两种工作溶液 均置于棕色玻璃样品瓶中，在 4 °C 的冰 箱中储存一个月。 配制 20:80 EtOAc/ACN 萃取溶剂和 16:64:20 ACN/EtOAc/水洗脱溶液，室温 储存。 仪器与材料 将 Agilent 7890B 气相色谱系统与 Agilent 7000D 三重四极杆 GC/MS 联用开展研 究。气相色谱系统配备电子气路控制 (EPC)、支持风冷的多模式进样口 (MMI)、 Agilent 7693A 自动液体进样器 (ALS) 以及 基于辅助 EPC 模块控制的吹扫 Ultimate 接 头的反吹系统。采用 Agilent MassHunter 工作站软件进行数据采集和分析。

样品前处理设备包括： • Centra CL3R 离心机 (Thermo IEC, MA, USA) • Multi Reax 试管振荡器 (Heidolph, Schwabach, Germany) • 2010 Geno/Grinder (Metuchen, NJ, USA) • 移液管和重复用移液器 (Eppendorf, NY, USA) • 安捷伦正压 48 孔处理装置 (PPM-48) （部件号 5191-4101） • Captiva EMR-Lipid 过滤柱，3 mL， 300 mg（部件号 5190-1003） • 陶瓷均质子（部件号 5992-9312）

仪器条件 GC/MS/MS 仪器条件基于先前发表的方 法确定11。表 2 列出了 GC/MS/MS 操作 条件。

图 1 显示了使用既定 GC/MS/MS 条件获 得的加标三文鱼样品中加标浓度为 1 ng/g 的各种 PAH 化合物的典型 MRM 色谱图。 样品前处理 深海捕捞的三文鱼和有机牛肉购自当地杂 货店，将它们切成小块，并储存在 –20 °C 下。使用机械研磨机通过干冰将冷冻样品均质化。然后称取均质化样品 (2.5 g) 至 50 mL 离心管中，并根据需要加入标准 品和内标溶液。然后使用图 2 所示的程 序对三文鱼和牛肉样品进行前处理，该程 序包括三个主要部分： 1. 通过两步固液萃取 (SoLE) 进行样品 萃取，如浅蓝色框中所示2. 使用 Captiva EMR-Lipid 过滤柱对样品 提取物进行净化，如浅紫色框中所示 3. 使用异辛烷反萃取 (BE) 进行除水后 处理，如浅绿色框中所示 整个工作流程将原始样品浓度稀释四倍。

基质共萃取物去除效率评估 对样品共萃取物残留进行重量测定，由此 考察基质去除率。利用失重测定法来测 定共萃取物残留量9 ，研究样品萃取和净 化程序的基质去除率。基于 1 mL 最终样 品提取物 (n = 2) 来采集共萃取物残留重 量，在适用的情况下校正稀释倍数，并利 用平均重量确定基质去除率 (%)。 也可基于 1 mL 样品干燥后剩余的残留物 的量直观观察 Captiva EMR 的净化效率。 方法验证 在三文鱼和牛肉样品的分析物回收率、定 量准确度和精密度、定量限 (LOQ) 和校准 曲线线性方面对优化的样品前处理方法进 行验证。三文鱼和牛肉样品的校准曲线 浓度包括 1、2、5、10、20、50、100、 250、400 和 500 ng/g。根据校准曲线对 三种浓度的三文鱼或牛肉 QC 样品进行定 量分析，且 n = 6。这三种 QC 样品分别 是低浓度 (1 ng/g)、中等浓度 (10 ng/g) 和高浓度 (100 ng/g) 样品。由保留时间 和 MRM 离子对确定分析物鉴定和定量 结果。

结果与讨论 EMR-Lipid 吸附剂和产品 EMR-Lipid 吸附剂使用新型化学键合相，它 结合了体积排阻与疏水相互作用，可提供 较高的脂质去除选择性和效率。仅含有无 支链烃链的类脂分子能够进入 EMR-Lipid 吸附剂孔中，并通过疏水相互作用得以保 留。不含类脂结构的目标分析物无法进入 吸附剂孔中，因此留在溶液中以供后续分 析。因此，EMR-Lipid 吸附剂可以将脂质 与其他目标分析物分开，提供较高的分析 物回收率和脂质去除效率。 样品前处理优化 样品前处理方法优化包括三个阶段： 1. SoLE 2. Captiva EMR-Lipid 净化 3. 用于除水的后处理 萃取步骤对于实现脂肪基质中疏水性 PAH 化合物的高回收率至关重要。样品萃取的 挑战在于 PAH 分析物的高疏水性和脂质食 品基质的复杂性。鉴于 SoLE 先前在萃取 油基质中疏水性农药方面的成功应用9 ， 直接使用 SoLE 和 20:80 EtOAc/ACN 萃取 溶剂作为初步方案。针对分析物回收率对 萃取时间和多次 SoLE 进行优化，结果如 图 3A 所示。结果表明，萃取时间越长， PAH 萃取回收率越高。另外，与一步法 SoLE 相比，两步法 SoLE 提高了萃取效 率。因此，使用两步法 SoLE 作为最佳萃 取方法，该方法采用 5 mL 萃取溶剂，并 在每一步振摇 10 分钟。

然后研究了 EMR-Lipid 过滤柱净化的分 析物回收率。由于 PAH 化合物具有非常 强的亲脂性（重 PAH 尤其如此），因此 使用二次洗脱对于获得良好的洗脱回收 率非常重要。结果（图 3B）表明，二次 洗脱能够使洗脱回收率平均提高约 20%– 25%。此外，使用更强的溶剂（16:64:20 EtOAc/ACN/水）可实现重 PAH 的最佳 洗脱。 对样品萃取和 EMR-Lipid 净化进行优化 后，考察了用于除水的后处理步骤。用于 在 GC/MS/MS 分析之前除水的 EMR-Lipid 后处理方法主要有三种： • 使用无水 MgSO4 进行盐析 • 干燥和复溶 • 疏水性溶剂反萃取 (BE) 表 3 分别列出了这三种后处理程序的一 般方法、优缺点和适用性。由于 PAH 是 一类强疏水性化合物，因此非常适合采用 疏水性溶剂反萃取法。该方法可实现溶 剂转换和部分浓缩，并且对于轻 PAH 和 重 PAH 化合物均适用。因此，在 Captiva EMR-Lipid 净化后使用异辛烷溶剂 BE 除水。图 3C 显示了异辛烷 BE 步骤的回 收率。 使用这种优化的方法，在三种加标浓度下 采集整个方法的分析物回收率：三文鱼 和牛肉样品中加标浓度均为 1 ng/g、10 ng/g 和 100 ng/g (n = 6)。尽管不同基质 间存在差异，但两种基质中不同加标浓度 的所有 PAH 分析物的回收率均处于可接 受的限值范围 (50%–120%)。