采用UPC2 /MS简单快速地分析游离脂肪酸

简介：游离脂肪酸和构成复合脂质的脂肪酸都在代谢中发挥着一些关键作用 ——作为主要的代谢燃料(储存和运输能量)、所有细胞膜成分和基因调控因子。此外，膳食中的脂质可提供多不饱和脂肪酸， 这类脂肪酸是功能强大的局部作用代谢产物(如类花生酸)的前体。 常见的动植物来源脂肪酸均为偶数链，每条链含16至24个碳原子，并 具有0到6个双键。但是大自然中总有着无数的例外，实际上甚至还存 在多达近100个碳原子的奇数碳和偶数碳脂肪酸。此外，双键可以为顺 式(Z)和反式(E)构型，也可以具有各种其它结构特征，包括分支点、环、 含氧官能团等等。 脂肪酸链可以在特定的位点含有一个或多个双键(具有顺式(Z)或反式(E) 构型的不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸)，也可以是*饱和的。 LIPIDMAPS脂肪酸系统命名法用“∆”指示双键相对于羧基的位置1 。脂肪酸 结构在分子的一端(Omega，ω)含有一个甲基，另一端为羧基。 靠近羧基的碳原子称为α碳，紧接着下一个碳原子则称为β碳。通常，还 会使用字母“n”代替ω，以指示离甲基端最近的双键位置2 。图1展示了不 同直链脂肪酸的结构。 从生物材料中分离游离脂肪酸(FFA)是一项复杂的工作，必须随时注意防 止或尽量减少水解酶的影响。完成分离后，可通过典型的色谱方法对脂 肪酸进行分析，包括气相色谱/质谱法(GC/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC/ MS/MS)。但是，这些方法都有着各自的不足之处。 例如，GC法需要将脂肪酸进行衍生化，以便水解并转化为甲酯，这一过 程不仅耗时，而且在衍生化过程中还存在脂肪酸重排的风险，使得无法 确定形成的酯是来自FFA还是完整的复合脂质。此外，对于具有高分子量 (>C24)的低挥发性极长链脂肪酸来说，即使在脂肪酸甲酯(FAME)衍生化后， 其GC/MS分析依然存在问题。

在LC/MS方法中，虽然不需要进行样品衍生化，但运行前的样品制备过程费时费力，并且采用 的毒性有机溶剂价格昂贵，处理费用也很高。而在典型的反相(RP) LC/MS分析中，则必须将含 有所有脂质的有机提取物蒸干，再使用相容性更好的进样溶剂进行复溶。 因此，如果有一种简便的脂肪酸分离和测定方法，将会有很大帮助。我们在此展示了一种快 速、高通量和高效的FFA分离和分析方法，其中采用了带有质谱分析的超高效合相色谱(UPCC 或UPC2 )。 UPC2 是一种互补的正交分离技术，正逐渐成为与LC和GC并列的第三大技术。尽管这三种技术 都是利用固定相与目标化合物相互作用，并利用流动相使化合物移动通过固定相，从而实现 分离，但它们所采用的流动相却有所不同。 GC采用气体作为流动相，LC使用液体作为流动相，而CC则同时使用了气体和液体。正是这种 流动相的合并以及更多的固定相选择使得CC成为实验室科学家的又一个强大选择。由于UPC2 可以分析溶于有机溶剂(例如己烷和氯仿)中的样品，因此大大简化了对于样品制备的要求， 同时还保留了RPLC的所有优势。 在此，对游离形式的脂肪酸而非FAME衍生物的分析实现了更简单快速的样品制备。含有全部 FFA的有机相提取物可以直接注入系统中，显著节省了样品制备和分析时间、溶剂成本和溶剂 弃置处理成本。此外，还避免了衍生化步骤造成的干扰形成。

实验 方法条件 UPC2 条件 系统： ACQUITY UPC2 色谱柱： ACQUITY UPC2 HSS C18 SB 1.8 µm, 2.1 x 150 mm 柱温： 50 ˚C 样品瓶： 总回收样品瓶 (p/n 186000385C) 样品温度： 10 ˚C 进样体积： 0.5 µL 流速： 0.6 mL/min 流动相A： CO2 流动相B： 甲醇的0.1%甲酸溶液 补偿液： 甲醇的0.1% NH4OH溶液 (0.2 mL/min) 分流器： Upchurch四通1/16 PEEK 梯度 时间(min) %A (CO 2) %B 曲线 0.0 95 5 初始 5.0 75 25 6 5.1 50 50 1 6.0 50 50 11 8.0 95 5 1 MS 条件 质谱仪： Xevo G2 QTof 电离模式： ESI毛细管电压： 1.0 kV 锥孔电压： 30 V 源温度： 100 ˚C 脱溶剂气温度： 500 ˚C 锥孔气体流速： 10 L/h 脱溶剂气流速： 600 L/h 采集范围： 50-600 m/z

样品制备 FFA标准混合物 各种含偶数个碳原子C8至C24的饱和FFA标准品购自Sigma公司。不同 FFA标准品(GLC-85，FFA形式)的复杂模型混合物购自Nu-Chek Prep(美国 明尼苏达州伊利森)。表1列出了所分析的FFA标准品及其它详细信息。 用氯仿制备1 mg/mL储液和0.1 mg/mL工作脂质混合溶液，然后注入 UPC2 /MS系统中。 海藻和藻质素产油 海藻和藻质素在较低和较高的热解温度下进行加水热解所产生的油 由欧道明大学(美国弗吉尼亚州诺福克)提供。在(310 ˚C)的热解温度 下对海藻1和藻质素1进行处理；在(360 ˚C)的热解温度下对海藻2和 藻质素2进行处理。 通过改良的提取步骤提取藻质素。简而言之，使用1:1 (v/v)苯/甲醇溶 剂混合物，并采用索氏抽提法提取24小时，去除海藻中的脂质。在 60 ˚C下，将残留物质用2N氢氧化钠处理两小时。使用过量去离子水 洗涤剩下的残留物质，接着用Dowex 50W-x8阳离子交换树脂进行处理， 置换所有残留的钠。最后，用去离子冲洗固体。用二氯甲烷将油样 稀释10倍，取1 µL注入UPC2 /MS系统中。 数据采集和处理 通过多变量数据分析进行样品对比时，关键在于使每个样品随机化 并至少进样三次，以确保数据分析在统计学上有效。对于此项研究， 在MSE 模式下采集了每种海藻和藻质素油提取物的五次重复进样，该 模式是一种无偏差的Tof采集方法，其中当进行交替扫描时质谱仪在 低碰撞能量和高碰撞能量之间切换。采用TransOmics代谢组学和脂类 组学信息学软件(TransOmics Informatics for Metabolomics and Lipidomics，TOIML) 进行数据分析和FFA鉴定。

结果与讨论 饱和FFA标准品的分析 图2显示了碳链长度为C8至C24的饱和FFA的分离。ACQUITY UPC2 高强度硅胶颗粒(HSS) C18 SB 1.8 µm， 2.1 x 150 mm色谱柱提供了类RP分离，可实现不同种类FFA的有效分离。在酸性条件下，采用比例 较小的甲酸(0.1% v/v甲醇溶液)运行梯度，以改善峰形并减少峰拖尾现象。 ACQUITY UPC2 方法比GC/MS和RPLC方法快10倍(运行时间仅需三分钟)，并且使用毒性较小、更为经 济的CO2作为溶剂。典型的脂类组学研究涉及上千个生物样品的分析，更快的速度意味着可以 高效地分析较大的样品量，从而提升了实验的整体效率。 FFA脂质分子的分离原理主要基于FFA碳数量和双键数量与HSS C18 SB材料之间的疏水性相互作用。 因此，不同FFA的洗脱顺序取决于脂肪酸链的长度和双键数量。酰基链越长、越饱和，保留时 间也就越长。 通过优化共溶剂流动相B(甲醇的0.1%甲酸溶液)，可以增加色谱分离度和峰容量。共溶剂的百 分比越高，保留时间就越短并且峰越窄。但是，在分析含有碳链长度不同的饱和与不饱和FFA 的复杂生物样品时，峰容量对于减少共洗脱脂质非常重要。因此，我们采用甲醇的0.1%甲酸溶 液以5%至25%的共溶剂梯度进行进一步的分析。