单克隆抗体多个关键质量属性的评估 和可比性评估

摘要：基于多属性方法 (MAM) 的 LC/MS 肽谱分析在生物制药分析领域受到了广泛的关 注。本应用简报展示了使用 LC/MS 肽谱分析方法对不同单克隆抗体 (mAb) 的关键质 量属性 (CQAs) 进行的表征和定量分析。将肽谱分析结果与传统方法进行了比较，结 果表明，肽谱分析与传统方法对赖氨酸截短、氧化、脱酰氨基化、N 端环化和糖基 化程度的估算高度相似

前言：单克隆抗体 (mAbs) 来自正处于快速生长 期的生命系统。由于其生物来源，这些复 杂分子在生产过程中会经历各种翻译后 修饰 (PTMs)，从而导致明显的异质性。 在 mAbs 的开发和生产过程中，将这些 意外修饰作为 CQAs 进行表征和监测至关 重要。由于每种 CQA 的化学性质不同， 传统上有几种检测方法可执行此分析，每 种技术都有各自的优缺点。近年来，基于 LC/MS 的多属性方法 (MAM)[1] 获得了广 泛的应用，因为它有望提供一种对 mAb CQAs 进行全面表征的单一方法，与传统 方法相比，该方法可有效节省分析时间和 成本。然而，在将 MAM 方法应用于严格 监管的质量控制环境之前，必须先验证传 统分析方法与肽谱分析结果的对应准确 性。重要的是确保肽谱分析工作流程可提 供与传统分析方法相当的结果。本研究比较了肽谱分析方法与传统分析 方法（包括离子交换色谱法、亲水相互 作用色谱法 (HILIC) 和亚基水平反相色谱 法）的性能。使用由 Agilent AssayMAP Bravo 液体处理平台、Agilent  1290 Infinity II 液相色谱系统和 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF，以及用于数据分 析的 Agilent MassHunter BioConfirm 软件 组成的一体化工作流程对 mAbs 进行了肽 谱分析。比较了肽谱分析方法与传统分析 方法对各 CQA 的相对 (%) 定量结果。

实验部分：材料 mAb1、mAb2 和 mAb3 购自当地经销商 （新加坡），并根据制造商的使用说明进 行储存。三羟甲基氨基甲烷、Tris-HCl、 盐酸胍、三(2-羧乙基)膦 (TCEP)、碘乙 酰胺 (IAA)、甲酸、三氟yi酸、磷酸二氢 钠、磷酸氢二钠、氯化钠和 LC/MS 级溶 剂购自 Sigma-Aldrich。IdeS 蛋白酶购自 Genovis。高品质测序级胰蛋白酶来自安 捷伦科技公司。

实验方法 电荷异构体：将样品直接进样，无需稀释 (10 mg/mL)。表 1 和表 2 列出了 mAb1 和 mAb2 针对弱阳离子交换 (WCX) 色谱 法的色谱参数。对收集的 WCX 馏分进行 了胰蛋白酶酶解和肽谱分析。 氧化：将 5 µL mAb 样品（2 mg/mL，溶于 Tris-HCl 缓冲溶液）加入 5 µL IdeS 蛋白酶 中，30 °C 下孵育 30 分钟，冷却至室温 后进行分析。 游离多聚糖：使用 AssayMAP Bravo 液体 处理系统和 GlykoPrep 快速 N-糖试剂盒 (GPPNG-PC) 进行标记 N-糖样品前处理[2]。 通过 HILIC 实现标记 N-糖的分离。 胰蛋白酶酶解 将收集的 WCX 样品和 mAb 样品馏分还 原/烷基化，并用胰蛋白酶酶解，然后 使用 Agilent AssayMAP Bravo 液体处理 平台对其进行脱盐处理[3]。简而言之， 将含有 mAbs 的样品板复溶于变性缓冲 液（含 5 mmol/L TCEP 和 150 mmol/L Tris 的 8 mol/L 盐酸胍，pH 8）中，并 在 60 °C 下温育 60 分钟。在进行变性和 二硫键还原后，加入 133 mmol/L 碘乙酰 胺（室温下 40 分钟）对游离的半胱氨酸 进行烷基化。然后将样品酸化并用 1.75% TFA 进行稀释。接下来，使用 RP-W 小柱 对样品进行蛋白质纯化应用，并在 37 °C 下进行胰蛋白酶过夜酶解（蛋白质与 蛋白酶比例 20:1，w:w）。随后，通过 AssayMAP 试剂转移工具使用 0.1% 甲 酸对样品进行酸化，以终止胰蛋白酶的 活性。使用 C18 反相柱执行 AssayMAP Bravo 肽段纯化方案（脱盐）。

结果与讨论 C 端赖氨酸截短 由于羧肽酶的活性，重链 C 端赖氨酸的 截短是常见的 PTM。赖氨酸残基的丢失 会减少 mAbs 的净正电荷，从而导致电 荷异质性。通过阳离子交换色谱 (CEX) 可 以很好地分离 C 端赖氨酸异构体（含赖 氨酸和不含赖氨酸)。图 1A 显示了使用 Agilent Bio MAb PEEK 色谱柱分析 mAb1 获得的电荷异构体图谱的高分离度分离和 三个不同的峰。13.11 分钟处的峰记为主 峰 (M)。早洗脱和晚洗脱峰分别称为酸性 异构体（A1 和 A2）和碱性异构体（B1、 B2、B3、B4、B5 和 B6）。图 1A 的表格 列出了主峰、酸性电荷异构体和碱性电荷 异构体的峰面积百分比。在通过 LC/MS 肽谱分析表征 C 端赖氨酸截短之前，将 电荷异构体峰收集作为单个馏分，并将 多次进样的结果进行合并。基于肽谱分 析，使用 C 端赖氨酸截短异构体对 CEX 峰进行标注。通过羧肽酶 B (CPB) 处理， 进一步证实了 C 端赖氨酸的异质性。由 电荷异构体峰的面积百分比计算得到的 C 端赖氨酸截短的相对含量为 58.28%

在基于肽谱分析的 C 端赖氨酸异构体图 谱定量中，对 mAb1 进行了 LC/MS 肽谱 分析。图 1B 所示为 mAb1 的 LC/MS 肽 谱分析结果。MS/MS 分析确认了修饰和 未修饰重链 C 端赖氨酸截短肽的归属， 并鉴定得到其相对含量为 55.30%。 表 3 所示为传统 CEX 和肽谱分析方法用 于 C 端赖氨酸截短异构体定量的比较。 两种方法估算的 C 端赖氨酸截短的相对 含量相当。