三重四极杆液质联用系统定量分析替丁类药物中的 N-亚 硝基er甲胺

摘要：本应用简报介绍了采用 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统检测替丁类药物中的 N-亚 硝基er甲胺 (NDMA) 的方法。该方法可以有效避免替丁类药物受热不稳定而分解出亚硝胺 的问题，检测结果准确、重现性好、特异性强，且灵敏度优于 NDMA 目前的法规*要 求（96 ng/天）。该方法适用于对盐酸雷尼替丁、枸橼酸雷尼替丁、尼扎替丁、西咪替丁 和法莫替丁等替丁类药物和制剂中的 NDMA 进行快速、准确的定量分析。

前言： 2019 年 9 月，FDA 爆出胃药雷尼替丁中含有超过*的亚硝胺类致癌物 N-亚硝基er甲胺 (NDMA)，随后出现大量涉及多个品牌的雷尼替丁药品召回事件[1]。这是继沙坦类药 物后，第二种被爆出含有超*亚硝胺类杂质的药物，并使得监管机构对其它可能遭受污 染的化学合成药物越来越警惕。

N-亚硝基er甲胺 (NDMA)，又称二甲基亚硝胺 (CAS 64-75-9)， 结构如图 1 所示，具有很强的肝脏毒性，属于亚硝胺类遗传毒性 杂质。根据世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单， NDMA 属于 2A 类致癌物，即“对人很可能致癌，此类致癌物对 人致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分”[2]。根据 FDA 之前的评估结果，将 NDMA 可接受*规定为 96 ng/天[3]。而 雷尼替丁 (Ranitidine) 的结构中含有亚硝胺类似基团（见图 1）， 根据 FDA 的研究[1]，其受热后会分解出 NDMA。因此，不适合采 用 GC-MS 检测雷尼替丁，而需要利用更温和的 LC-MS 技术。同 样，从结构角度来看，在其他替丁类药物的分析中也要考虑热不 稳定问题。 关于雷尼替丁中 NDMA 的检测，FDA 在 2019 年 9 月公布了 LC-HRMS 和 LC-MS/MS 方法[1]；欧洲 OMCL 实验室推荐采用 LC-MS/MS 方法[4]；同期，我国药品监管部门也发布了雷尼替丁 的推荐 LC-MS/MS 检测方法，并于同年 10 月，将方法扩展到 其他替丁类药物（枸橼酸雷尼替丁和尼扎替丁等）。值得一提的 是，在三大机构的推荐方法中，都用到安捷伦三重四极杆液 质联用系统。 本研究依据中国食品药品检定研究院替丁类药物中 NDMA 推荐检 测方法的要求，采用定量的金标准三重四极杆液质联用系统进行 测试。该方法有效避免了替丁类药物受热不稳定而分解出亚硝胺 的问题，灵敏度高、特异性强且重现性好，适用于定量分析盐酸 雷尼替丁、枸橼酸雷尼替丁、尼扎替丁、西咪替丁和法莫替丁等 替丁类药物中的 NDMA。

实验部分：试剂和样品 甲醇为质谱级，甲酸为色谱级，购自 Merck；所用实验用水为利 用 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水；NDMA 标 准品溶液及样品由合作用户提供。 仪器和设备 采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱系统与 6470 三重四极 杆质谱联用，其中色谱系统配备二元泵（部件号 G7120A）、自动 进样器（部件号 G7167B）和柱温箱（部件号 G7116B），质谱系 统配备大气压化学电离 (APCI) 离子源。为确保替丁类药物与 NDMA 有效分离，色谱柱选用 Agilent EclipsePlus C18 RRHD（3.0 × 150 mm, 1.8 µm，部件号 959759- 302）。

标样配制 取 NDMA 标准品溶液（1000 mg/L 甲醇溶液），用适当溶剂（与 样品前处理采用相同的溶剂）逐级稀释成每 1 mL 中分别含 1、 2、5、10、50、100、500 ng 标准品的溶液，作为校准标样。并 将 1 ng/mL 溶液稀释三倍，作为灵敏度测试溶液。 样品前处理 对于原料药，建议称取日最大摄入量。加 10 mL 水或甲醇（取决 于药物溶解度），振摇使其溶解后，离心，取上清液检测。 制剂和片剂经预先研磨后称重，胶囊则取内容物称重，建议称 取日最大摄入量。加 10 mL 水或甲醇（取决于药物溶解度），摇 匀，涡旋混合 1 min，再振摇 40 min，离心后取上清液进行检 测。由于替丁类药物热稳定性差，因此应避免使用可能产热的剧 烈操作（如超声等）。 液相色谱条件 色谱柱： EclipsePlus C18 RRHD, 3.0 × 150 mm, 1.8 μm 流速： 0.4 mL/min 柱温： 40 °C 流动相： A) 0.1% 甲酸水溶液 B) 甲醇 梯度程序： 时间 (min) B (%) 0.00 5.00 3.50 5.00 4.50 20.00 4.60 100.00 10.00 100.00 10.10 5.00 11.00 5.00 后运行时间： 2 min

质谱条件 离子源： APCI 离子源 雾化气、干燥气及碰撞气： 氮气 雾化气压力： 35.0 psi 干燥气温度： 300 °C 干燥气流速： 5 L/min 蒸发室温度： 350 °C VCap 电压： 1500 V 电晕针电流： 6 μA 检测模式： 多反应监测 (MRM) MRM 参数： 如表 1 所列

结果与讨论：色谱分离结果 本研究选择适合的反相色谱柱，结合梯度洗脱，利用 NDMA 的弱 保留性，使其与高浓度替丁类药物分离。同时利用药典推荐的紫 外吸收信号监测高浓度药物的洗脱情况，结果如图 2 所示，所有 替丁类药物均在 NDMA 后洗脱，不会干扰 NDMA 的测定。本实 验条件下，NDMA 的保留时间约为 3.5 min，与各类替丁药物分 离良好。 为避免污染质谱系统，在 NDMA 出峰前后，推荐流路设置“引入 废液”。另外，建议高比例有机相冲洗较长时间，保证高浓度 API 及辅料等物质*洗脱。