使用 LC/MS 分析完整腺相关病毒衣壳 蛋白实现快速产品确认

前言：腺相关病毒 (AAVs) 是一类非常有应用前景的新型生物疗法，能够治疗许多罕见、棘手的遗传病，例如脊髓性肌肉和遗传性视网膜变性[1]。AAVs 是由蛋白质衣壳和包裹 DNA 组成的大分子复合物，分别需要使用专用分析技术以确保整体产品的质量和安全性。AAV 衣壳由三种不同的衣壳蛋白组成，通常以 VP1–3 表示，其化学计量比约为 1:1:10，每个衣壳共含 60 个蛋白质拷贝[2]。美国食品药品监督管理局建议，在产品放行前需明确鉴定所有 AAV 治疗药物的病毒衣壳和包裹 DNA，特别是生产多种血清型或基因工程变异体的生产设施[3]。迄今为止，基于抗体的方法（例如 ELISA 和免疫印迹法）已成为常用的病毒衣壳分析技术。这些方法存在几个弊端：基于抗体的方法不仅繁琐且易于出错，还要求针对分析的每种 AAV 类型生成高度特异性的抗体。这挑战性，因为来自不同产品的 AAV 衣壳可能高度同源，例如，AAV 血清型 1 和 6 仅相差 6 个氨基酸（99% 同源），这使得它们很难通过抗体结合进行区分[4]。原则上，由于 LC/MS 直接测量蛋白质质量数，无需针对每种类型的 AAV 生成抗体，因此可实现快速且高特异性的病毒衣壳蛋白分析。然而，在以往的研究中，病毒衣壳蛋白的色谱分离结果相对较差[5]。这很成问题，因为共洗脱不仅会妨碍衣壳化学计量（AAV 感染性的重要决定因素）的准确定量，还会影响信号强度和质量数准确度[6]。

本应用简报介绍了一种优化的 LC/FLDMS方法，用于快速分析 AAV 衣壳蛋白，确认 7 种不同血清型的一级结构。该方法具有简单的样品前处理要求，并可稳定用于高盐条件以及常用的非离子型清洁剂添加剂 Pluronic F-68。

实验部分：AAV 样品AAV 血清型 2、7、9、7m8、DJ、rh10和 Anc80 均购自 Vector Core @ GIS(A*STAR, Singapore)。AAV 样品经三次转染在 HEK-293 细胞中表达，并通过分析型超速离心法进行了纯化处理。在含有 0.001% Pluronic F-68 的磷酸盐缓冲液中，样品浓度约为 1.2 × 1010个病毒基因组/µL，收到样品后即可使用，无需更换缓冲液。

样品前处理每次分析都新鲜配制含有 12 mol/L 盐酸胍 + 40 mmol/L DTT 的 200 mmol/L碳酸氢铵（pH  值约为 8.0）的变性缓冲液。将变性缓冲液以 1:3 的比例加入AAV 样品中，使最终盐酸胍的浓度达到3 mol/L。然后将样品加热到 70 °C 并保持 15 分钟，确保其*变性。每次分析进样 1.5 × 1011 个病毒基因组。LC/FLD-MS 用于完整衣壳蛋白分析使用以下仪器对样品进行了分析：• Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统，包括：• Agilent 1290 Infinity II 高速泵(G7120A)• Agilent 1290 Infinity II Multisampler(G7167B)• Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B)

• Agilent 1260 Infinity 荧光检测器(G1321B)，配有 8 µL 流通池• Agilent 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF使用 A g i l e n t ZO R B A X R R H D 3 0 0 ÅStableBond C18 (SB-C18) 和 SB-Diphenyl，2.1 × 100 mm, 1.8 µm 色谱柱（部件号858750-902 和 858750-944）进行分离。还使用 ZORBAX RRHD 300Å SB-C3 色谱柱（部件号 858750-909）进行了方法开发，但不是优化方法。选择了由 0.1% TFA + 0.1% FA 的去离子水溶液 (mp A) 和 90% 异丙醇 + 9.8% 水 +0.1% TFA + 0.1% FA (mp B) 组成的高洗脱强度流动相。结合高温，类似的流动相条件在 ZORBAX StableBond 色谱柱上实现了单克隆抗体分析的出色分离能力[7]。

由于芳香族残留物的发射光谱可能会因溶剂暴露量和暴露程度的不同而有所差别，因此使用具有单激发 (280 nm)/多发射（315、330、345 和 360 nm）模式的8 µL 流通池进行荧光检测。结果显示，360 nm 处的发射强度最高，因此使用该波长进行所有分析。所有数据分析均在Agilent BioConfirm 10.0 中进行。表 1、表 2 和表 3 列出了仪器和软件设置。

LC/MS 肽谱分析将 10 µL 含有 6.0 × 1011 个病毒基因组的AAV 2（约 3.6 µg 蛋白质）样品变性，并在30 µL 含有 760 mg/mL 盐酸胍 + 3.8 mg/mLTCEP 的 150 mmol/L Tris-HCl (pH 8) 中进行还原，并在 60 °C 下温育 60 分钟。冷却至室温后，加入 10 µL 133 mmol/L碘乙酰胺进行烷基化，并在室温下避光温育 30 min。然后使用 210 µL Tris-HCl稀释样品，并加入 0.2 µg Promega 测序级修饰型胰蛋白酶（货号 V5117）。在 37 °C 下酶解 2 小时，然后再加入0.2 µg 胰蛋白酶，在 37 °C 下酶解过夜。第二天，加入 30 µL 10% 甲酸终止反应，

然后使用 Agilent AssayMAP Bravo 系统 (G5542A) 进行 C-18 净化。在配备 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF的 1290 Infinity II 液相色谱仪上进行肽谱分析。使用 AdvanceBio 肽谱分析色谱柱（部件号 653750-902），2.1 × 150 mm,2.7 µm 进行分离。表 4 和表 5 列出了仪器设置。

结果与讨论： LC/MS方法开发由于 AAV-2 的研究较为充分，因此使用该血清型进行了方法开发。衣壳蛋白VP1–3 的序列如图 2 所示。所有衣壳蛋白均由 Cap 基因中的相同 DNA 序列转录得到，通过 mRNA 剪接和渗漏核糖体扫描机制形成三种高度同源的蛋白质[6]。其中，这三种蛋白质的 VP3 序列均相同，而 VP1 和 VP2 仅 N 端序列有所不同。