应用气相-三重四极杆质谱对不同基因型大米的代谢组学研究

关键词 全自动 SRM 离子对优化软件（AutoSRM）；生物标记物；食 品；代谢组学；MRM；营养学；大米

前言 代谢组学是一门应用高通量测试平台研究生物代谢过程中的小 分子代谢物的科学。作为生物体内众多代谢反应的产物，其代 谢物的含量始终处于动态变化中。因此，所谓“代谢组特征” 反映的是来自于活体组织的生物样本的生理状况。1 对于植物来说，其代谢组主要受遗传基因以及环境影响等外部 刺激作用而在生长过程中不断变化。因而，通过测试所获得的 代谢组特征仅为该植物某组织器官在特定生长阶段生理状况的 剪影。对样本中代谢物的定性和定量结果可作为此代谢组状态 的“指纹图谱”或指示谱图。据估计，所有植物生长过程中存 在超过 20 万种代谢物，这些代谢物数量众多，结构复杂多样。2 代谢组学分析的大挑战在于代谢物结构性质的多样性以及含 量的巨大差异。要对整个代谢组体系中的代谢物进行测试，必 须应用多种测试平台。 对于研究可通过化学衍生法处理进行气相色谱分析的低分子量 代谢物来说，气相色谱与质谱联用（GC-MS）是测试 工具。在使用气质联用仪一级全扫描模式表征代谢物，可识别 相关代谢物并提供其归一化相对含量信息，然而，对代谢物整 体定量研究的要求是获得准确的定量信息。在研究大米等 某一植物时，需要对作为功能基因组学工具或区别不同种属、 品质大米的生物标记物的目标代谢物进行准确定量

三重四极杆质谱仪由于其在复杂有机样本中对待测物进行定性 和定量的能力而成为代谢组学研究中价值的工具之一。3, 4 三重四极杆质谱的主要优势是利用其多重反应监测（MRM）功能，一次进样同时定性和定量上百种代谢物。MRM 数据采 集模式通过监测目标代谢物*的、保留时间相关的母离子子离子转化反应，有效消除基质和噪音的干扰。并且，共流出 化合物也可以分别定量，无需通过数学计算进行解卷积处理。 作为一种食物来源，大米对于我们至关重要，它为约 21% 的 人口提供了能量供给（http://www.knowledgebank.irri.org/）。 大米的代谢组研究可用于对不同大米样本进行“指纹图谱” 识别，以鉴定出具有发展潜力的种属，从而拣选更好品质、 具备更多营养成分的大米。位于菲律宾马尼拉的稻米研究 机构（International Rice Research Institute, IRRI）是目前亚洲 大的非营利性农业研究中心。IRRI 以提高稻米产量和营养成 分为目标，专注于稻米的新品种开发。本次分析目的是考察 GC-MS/MS 测试平台对于检测不同基因型成熟稻粒目标代 谢物的适宜性。本实验与 IRRI 合作完成，旨在建立表征不 同种类稻米的代谢特征的测试流程。

 样品前处理 大米提取物的衍生化处理依据 Zhou 等人5发表的用于表征糙 米代谢组学特征而优化的方法完成。将新鲜脱壳的稻粒浸泡于 液氮中，之后研磨过 60 目网筛。称量 300 毫克糙米粉末，加 入 3 mL 甲醇/水溶液（4:1 v/v），另加入 100 µL 癸酸溶液 （0.30 mg/mL）作为内标物质。上述样本涡旋 1 分钟并静置 30 分钟，经超声处理 60 分钟后 12000g 离心 10 分钟。取 2 mL 上清液冻干，加入 90 µL 含 1%*基氯硅烷（TMCS） 的双*基硅烷基三氟yi酰胺（BSTFA）和 80 µL 吡啶进行衍 生化。混合物经 75℃ 水浴 45 分钟后移入装有 200 µL 内插管 的 2 mL 气相色谱样品瓶中，用于 GC-MS/MS 分析。所有样 本均在衍生化处理后 24 小时内完成测试。5 实验条件 12 份大米提取物衍生化样本均应用 Thermo ScientificTM TSQTM 8000 三重四极杆 GC-MS/MS 系统联用 Thermo ScientificTM TRACETM 1310 气相色谱分析，气相色谱仪同时配备有分流不 分流进样口 SSL 即时连接的 SSL 模块和 Thermo ScientificTM TriPlus RSHTM 自动进样器。具体仪器方法见表 1。

图 1 展示了代谢组学研究的通用测试流程，首先是第一部分， 无目标性地检测样本中化合物成分；之后进行第二部分，对第 一部分中鉴定的代谢物进行目标性的定量分析。 第一部分分析需要通过对一级质谱全扫描数据进行谱图数据库 检索来完成相关化合物鉴定。 第二部分分析则通过选择性反应监测（SRM）模式来对复杂 基质中痕量化合物进行准确定量。 终用于选择性定量的多重反应监测（MRM）是由众多单独 的选择性反应监测组成的。

TSQ 8000 系统同时进行一级质谱全扫描和 SRM 扫描的能力出 色，能够直接采集到第一部分和第二部分所需要所有数据。仪器 同时进行一级质谱全扫描和 SRM 扫描的能力使得实验人员可以 在一次测试中不仅对已知代谢物定量（目标性）的同时，鉴定未 知代谢物（无目标性）。在所有测试流程中，化合物的色谱保留 时间是不变的，这一点不仅可作为化合物鉴定的依据之一，更可 以加快建立目标性 MRM 测试方法进程。因此，Thermo Scientific TSQ 8000 三重四极杆质谱系统是同时进行未知化合物表征以及 目标化合物广泛定量的理想测试平台。 本次应用 TSQ 8000 GC-MS/MS 系统进行代谢组学研究的两部分 数据对于深入了解稻米品质具有重要参考价值。

结果 第一部分—无目标性分析 测试流程中的第一部分，共测试了 5 种不同的大米样本。之所以 选择这几种大米，是由于它们不同的特性，这样更有可能测试出 含量具有显著差异的代谢物。测试样本的一级全扫描离子流图见 图 2。 选择其中一个样本（3 号样本）来建立和优化 SRM 方法。这个 样本中含有大量有意义的代谢物。 TSQ 8000 三重四极杆质谱仪配置了全自动 SRM 离子对优化 （AutoSRM）功能，这个软件包可以快速、自动化地建立和优化 SRM 分析方法。利用该功能建立一个优化 SRM 方法步骤如下：1.分析母离子—根据一级全扫描数据，选择出 66 种感兴趣的 代谢物，每个代谢物选择 2–3 个母离子。本步骤需要单独进 行一次 GC-MS/MS 测试，选择出的相关母离子将进行进一 步的子离子分析。 2.子离子分析—选出在第一步中各代谢物选出的母离子的相应 子离子。每个代谢物均被选出多个产物离子，这导致每个代 谢物有 3–7 对母离子子离子离子对用于 SRM 优化分析。 3.SRM 优化分析—优化每对母离子-子离子离子对的碰撞能 量，以获得大的离子强度，即灵敏度。在目标代谢物进入 质谱仪后，对其进行快速梯度能量轰击以提高离子强度。通 过实时直接控制仪器，在单次测试中试验了多个碰撞能量， 从而极大地缩短了建立和优化 SRM 方法所需要的周期。仅 测试了 5 针样品就所有 66 种代谢物的 SRM 方法优化。 通过质谱图自动解卷积和鉴定软件（AMDIS）对 TSQ 8000 测 试所得的复杂离子流图进行解卷积处理，并应用美国国家标准 与技术研究院（NIST）的质谱图数据库进行谱图检索。上述的 66 种进行 AutoSRM 优化的代谢物均通过 2011 NIST 质谱图数 据库检索匹配其一级全扫描质谱图以完成鉴定。

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结论 应用 Thermo Scientific TSQ 8000 对 IRRI 提供的不同基因型的 大米进行代谢组学表征研究，旨在鉴定出能够区别不同种类、 品质大米的潜在生物标记物。无论代谢组学测试流程中的无目 标性分析还是目标性定量分析，TSQ 8000 均运行良好，展现了 它的一级质谱全扫描、SRM 和同时进行一级质谱全扫描 / SRM 扫描模式对于表征、定量宽动态范围内的主要代谢物的*优 势。 尽管 TSQ 8000 质谱仪是一台三重四极杆质量分析器，在一级 质谱全扫描模式下所获得的谱图仍与 NIST 标准谱库具有良好 的匹配度。通过标准谱库检索可对未知化合物进行匹配鉴定， 结果置信度高。同分异构体化合物则可根据其色谱保留时间不 同而进行区别，并可根据其特定的质谱碎裂特征进行选择性定 量。 利用 TSQ 8000 配置的 AutoSRM 软件包建立并优化大米样品中 包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、醇类、糖类（单糖、双糖）在 内的 66 种代谢物的 SRM 方法。整个 SRM 方法可在 24 小时以 内建立并完成优化，并对 12 种不同的大米样品中的代谢物进行 测试。定量结果具有高重复率，即使是在基质复杂的衍生化大 米提取物样品中，超过 90% 的代谢物 RSD 小于 15%。 经测试，所有目标代谢物在各大米样品中含量差异明显，均有 作为鉴定不同种类大米的生物标记物的潜力。本次实验对于未 来的水稻多样性研究打下良好基础，有助于提高稻谷品质和大 米营养价值。