采用LC/MS/MS 法同时定量分析人血清中20种抗癫痫药物

摘要：由于抗癫痫药物种类繁多，而且这些药物在人血清中的浓度可能差异很大， 导致监测抗癫痫药物非常具有挑战性。因此，用于这些药物的高品质分析 必须能够在多个数量级内同步监测多种化合物。液相色谱-质谱 (LC/MS/MS) 法就特别适用于这种分析。为了定量分析人血清中 20 种抗癫痫药物，开发 了一种灵敏度高、特异性好的方法。该方法通过一种简单的蛋白质沉淀/ 稀释方案配制样品。可在较宽的动态范围内定量分析物，重现性以 及 R2 值都非常出色。

前言 液相色谱-质谱 (LC/MS/MS) 检测方 法的主要优势在于其可在一次进样中 同时监测多种分析物。本研究使用 LC/MS/MS 分析方法来定量分析人血 清中的一组 20 种抗癫痫药物。与此相 反，由于相似分析物之间的浓度差异 较大，以往的分析通常只能监测少数 几种化合物。该组中的化合物包括： 乙酰瑞替加滨、卡马西平-10,11-环氧 化物、卡马西平、10,11-二氢-10-羟基 卡马西平、非氨酯、加巴喷丁、拉科 酰胺、拉莫三嗪、左乙拉西坦、奥卡 西平、苯妥英、普瑞巴 林、瑞替加滨、卢非酰胺、噻加宾、 托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸和唑尼沙 胺。分析方法使用 Agilent 6460 三重四 极杆质谱仪在宽浓度范围内同时检测 这些化合物。各种分析物的校准浓度 范围为 12 ng/mL 至 200000 ng/mL。高 浓度范围为 1.5 µg/mL 至 200 µg/mL。 通过将药物标准品加标到空白人血清 中配制样品。按照简单的蛋白质沉淀 方案配制用于分析的样品和对照，然 后用水稀释。进样、分离分析物、清 洗色谱柱和重新平衡色谱柱在 10 分钟内完成。对 20 个目标化合物中每个化 合物（包括丙戊酸）的两个离子对进 行监测。使用 15 个同位素标记内标来 显示差异抑制，并确保色谱图定量结 果的准确性和重现性。另外还对磷脂 的离子对进行监测，以验证这类内源 性分子的干扰小。 校准曲线准确度在低校准浓度下在 预期浓度的 20% 内，在较高浓度下在 15% 内。重现性良好，CV 均小于 15%， 甚至大部分还小于 10%。所有 R2 值均 大于 0.997，其中一些化合物在浓度范 围内呈现线性响应，而其他化合物则 需要二次拟合。

实验部分 化学品与试剂 用于基质匹配校准物的人血清购自 UTAK Laboratories (Valencia, CA)。标准 品和内标购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 和 Cerilliant Corporation (Round Rock, TX)。样品前处理和液相色谱溶 剂购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 和 Honeywell Riedel-de Haën (Seelze, Germany)。样品前处理 将 20 种药物标准品加标到空白人血清 中，得到高浓度样品。用空白血清以 1:2 连续稀释样品，得到 7 个较低浓度 的样品。将 40 µL 样品或对照与 40 µL 内标溶液在 120 µL 纯甲醇中混合。将 样品涡旋混合 30 秒后，在 10000 rpm 下离心 10 分钟。然后取 50 µL 上清 液加入 450 µL 水中，取 4 µL 进样到 LC/MS 系统。 数据分析 利用 Agilent MassHunter 采集软件 (B.08.00) 进行系统控制和数据采集。 利用 MassHunter Acquisition Optimizer 软件获得 MS/MS 离子对，在进样每 种化合物或内标的纯溶液时确定的母离子和碎片离子、碎裂电压和碰 撞能量。使用 Agilent MassHunter 定 量分析软件 (B.08.00) 和定性分析软件 (B.07.00) 分析数据。

结果与讨论 线性 本方法使用 LC/MS/MS 在宽浓度范围 内同时检测多种化合物（图 1）。各种 分析物的校准浓度范围为 12 ng/mL 至 200000 ng/mL。高浓度范围为 1.5 µg/mL 至 200 µg/mL，与曲线拟合参数一 起在表 1 中给出。所有 R2 值均大于 0.997，其中一些化合物在浓度范围内 呈现线性响应，而其他化合物则需要 二次拟合