使用安捷伦液质联用分析牛肉中的多类别兽药多残留

摘要： Agilent Captiva 增强型脂质去除 (EMR-Lipid) 过滤柱是第二代 Agilent EMR-Lipid 产品，采用固相萃取 (SPE) 形式，用于在不影响分析物回收率的情况下实现高选择性脂质去除。SPE 过滤柱提供了简便的直通式净化工作流程，只需极少的方法开发。萃取管经过优化，可在大体积样品净化过程中重力自洗脱，免除了控制真空或压力的麻烦。为促进脂类捕获并提高疏水性化合物的回收率，需要在 Captiva EMR-Lipid 吸附剂中加入 20% 水以活化 EMR 净化吸附剂。本研究展示了 Captiva EMR-Lipid 在分析牛肉中 39 种代表性多类别兽药中的应用。采用两步样品萃取，使亲水性和疏水性化合物均获得满意的回收率。然后将萃取液混合并加载到 Captiva EMR-Lipid 过滤柱上进行净化。评估了该方法的基质效应、分析物回收率和方法重现性。与其他过滤柱直通式净化产品相比，Captiva EMR-Lipid 过滤柱提供了更高效的基质净化和更出色的疏水性分析物回收率。

前言：兽药广泛用于动物食品中以预防动物疾病或作为生长促进剂。这些药物可能在动物组织中发生富集，使用不当会导致药物残留于食用组织中，对人类健康构成威胁。随着公众对食品安全的日益关注，大多数国家/地区都会对动物食品生产中使用的兽药进行监管1,2。动物食品（如肌肉、肝脏和蛋类）属于复杂基质；因此有必要在仪器分析之前使用高效前处理方法进行样品萃取、净化和浓缩。已有的样品前处理方法包括传统的溶剂萃取、固相萃取 (SPE) 或几项技术的组合。这些方法通常费力费时，仅适用于有限的化合物类别，并且需要进行方法开发。多类别多残留方法在监管性监测项目中越来越受青睐，因为它们可以扩大分析范围并提高实验室效率。过去几年，文献中已经报道了对 100 多种兽药的分析3-5。样品前处理通常涉及采用乙腈 (ACN)/水混合物进行预萃取，然后采用 C18 净化或其他净化技术的组合。然而，现有净化技术存在脂质去除效率低下和分析物意外损失等局限性。ACN/水混合物直接萃取可能影响萃取步骤中的蛋白质去除效率和疏水性分析物的可萃取性。安捷伦增强型脂质去除 (EMR-Lipid) dSPE 净化产品自 2015 年推出以来备受关注。EMR-Lipid 吸附剂通过体积排阻和疏水相互作用的组合机制，与脂类化合物的非支化烃链发生特异性相互作用。这种组合机制提供了高选择性脂质去除，且对目标分析物没有不良影响。该技术已被用于复杂基质中的多类别多残留农药分析，可提供基质净化和结果6,7。第二代产品 Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱减少了吸附剂活化所需的水分比例，且随后无需 Polish 净化盐析萃取步骤。这样简化了工作流程并改善了疏水性化合物在净化过程中的溶解度。

本研究考察了 Captiva EMR-Lipid 过滤柱净化在分析牛肉中 39 种棘手的代表性兽药的样品前处理过程中的应用。所选择的代表性兽药涉及 17 种不同类别，包括亲水性和疏水性药物，酸性、中性和碱性药物，以及一些难分析的类别，如四环素和 β-内酰胺。表 1 列出了药物类别、法规信息、保留时间以及用于分析这些兽药的 MS/MS 条件。

实验部分：试剂与化学品所有试剂和溶剂均为 HPLC 或分析纯级。乙腈 (ACN) 购自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。二甲基亚砜 (DMSO) 和脱水乙二胺四乙酸二钠盐 (NaEDTA) 购自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)。试剂级甲酸 (FA) 购自安捷伦公司（部件号 G2453- 86060）。兽药标准品和内标购自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)。溶液与标样用 DMSO 配制 2.0 mg/mL 的标样和内标 (IS) 储备液，以下储备液除外： • 用 DMSO 配制 1.0 mg/mL 的达氟沙星储备液 • 用 DMSO 配制 0.25 mg/mL 的环丙沙星储备液用水配制所有 β-内酰胺药物和头孢唑啉储备液，浓度为 2.0 mg/mL。除 β-内酰胺药物、头孢唑啉和四环素药物储备液在聚丙烯塑料管中配制以外，所有其他储备液均在棕色玻璃样品瓶中配制。所有溶液均保存于 -20 °C 下。根据其仪器响应不同，将 39 种化合物分为两组：第 1 组 (G1) 和第 2 组 (G2)。在 1:1 ACN/水中配制两种混合标准工作溶液，浓度分别为 25/5 µg/mL 和 5/1 µg/mL (G1/G2)。在 1:1 ACN/水中配制 25 µg/mL 氟尼辛-d3 IS 工作溶液。将 2 mL 甲酸和 2 mL DMSO 加入 100 mL 经预冷却的 ACN，每天新鲜配制冷萃取溶剂。将 1.8612 g NaEDTA 粉末溶于 50 mL Milli-Q 水中，制得 0.1 M NaEDTA 溶液。溶液在室温下保存。混合 80 mL ACN 与 20 mL Milli-Q 水，制得 80:20 ACN/水。

结果与讨论：简便易用的过滤柱净化使用 Captiva EMR-Lipid 过滤柱进行复杂样品基质净化的一个重要特征是简便易用。EMR-Lipid 吸附剂针对的是不需要的脂质干扰物而非分析物，并采用直通方法。将样品混合物加载到过滤柱上，使其穿过过滤柱中填充的 Captiva EMR-Lipid 吸附剂。脂类被捕集在吸附剂中，而目标分析物穿过过滤柱，无需活化、清洗和洗脱等传统的 SPE 步骤。因此，使用 Captiva EMR-Lipid 过滤柱大大简化了净化过程，节省了大量时间和吸附剂。直通式净化无需针对清洗和洗脱步骤进行传统的 SPE 方法开发。对 Captiva EMR-Lipid 的一种可能的方法改型是使用二次洗脱步骤以实现*洗脱。在二次洗脱时，建议使用 20:80 水/ACN 混合物，其体积为载样体积的 20%–25% 左右（例如，在载样体积为 5 mL 时，采用 1–1.25 mL 进行二次洗脱）。后，重力洗脱的产品设计使样品在加载到 EMR-Lipid 过滤柱上之后即可自动操作。无需通过调节真空度或正压来控制洗脱流速。这些特征使得在采用 Captiva EMR-Lipid 过滤柱净化来制备复杂的食品样品时，可获得更高的实验室工作效率。