使用安捷伦LC-MS/MS 对全血中的THC 和代谢物进行高效定量分析

摘要：复杂生物样品的高效提取、净化和分析对法医学实验室极为有益。磷脂 (PPL) 已被确定为在全血中四氢da麻酚 (THC) 及其代谢物的 LC-MS/MS 分析中引起基质效应的主要来源。本应用简报介绍了全血中的 ∆9 -THC (THC) 及其主要代谢物 11-羟基-∆9 - THC (THC-OH) 和 11-nor-9-羧基-∆9 -THC (THC-COOH) 的提取和 LC-MS/MS 分析。样品前处理中采用孔内蛋白质沉淀法 (PPT) 和 Agilent Captiva EMR-Lipid 直通 1 mL 过滤柱去除 PPL。Captiva EMR-Lipid 能够得到更洁净的洗脱液，去除全血基质中 97% 以上不需要的 PPL，且目标分析物的回收率高于 92%。对 1 ng/mL THC、THC-OH 和 THC-COOH 的分析得到了理想的峰形，并获得了良好的信噪比 (S/N)。在 0.5 至 100 ng/mL 范围内获得的响应呈线性，R2 高于 0.99。获得的定量限在 1.0 ng/g 以下，RSD 小于 11.5%。在三天的实验过程中，得到的结果一致。

前言：在法医学实验室中，LC-MS/MS 分析之前高效的样品前处理是一个重要考虑因素。样品前处理可用于减少系统污染并改善数据完整性、方法选择性、分析灵敏度和可靠性。全血中存在的两种主要干扰物为是蛋白质和磷脂 (PPL)。PPL 已被确定为 LC-MS/MS 生物分析中引起基质效应的主要来源，因为在电喷雾电离 (ESI) 期间所形成的液滴表面上会发生竞争电离1 。常用的法医学样品前处理技术包括蛋白质沉淀 (PPT)、固相萃取 (SPE)、液液萃取 (LLE) 和介质液液萃取 (SLE)。每种技术在速度、成本和生成数据的质量方面各有优劣。例如，PPT、 LLE 和 SLE 无法去除 PPL，而 SPE 执行起来更耗时且更复杂2 。然而，在这些技术中，PPT 得到了广泛的认可。PPT 以规定的比例向生物样品中加入有机沉淀溶剂（如乙腈 (ACN) 或甲醇 (MeOH)），可轻松高效地除去蛋白质。随着蛋白质的变性，它们形成的沉淀可通过过滤或离心得以去除。但 PPT 无法去除 PPL，因为 PPL 能够溶于有机沉淀溶剂中。大麻物质类是支持案件调查的法医学实验室中常见的目标分析物之一。快速、准确地确认并定量生物样品中的 ∆9 -THC (THC) 及其主要代谢物 11-羟基-∆9 -THC (THC-OH) 和 11-nor9-∆9 -羧基-THC (THC-COOH) 至关重要。然而，THC 及其代谢物在样品前处理过程中容易发生非特异性结合。迫切需要一种全血样品前处理方法，在减少样品前处理步骤（包括离线 PPT、离心、转移和稀释）的同时实现简化的孔内 PPT 和 PPL 去除。本应用简报介绍了一种借助 Agilent Captiva EMR-Lipid 1 mL 过滤柱去除干扰物质（特别是 PPL）的方法，该方法采用简单的直通形式，不会引起分析物损失。所得的提取物更洁净，减少了潜在的离子抑制以及色谱柱和质谱仪污染。

依次使用孔内 PPT 和 Captiva EMR-Lipid 过滤柱去除 PPL，对全血中的 THC、THC-OH 和 THC-COOH 进行提取。随后使用 Agilent 6490 三重四极杆液质联用系统进行定量分析。对 PPL 去除率进行了评估。还测定了 THC 及其代谢物的日间（3 日）准确度、精密度和回收率。有关血浆样品的分析，请参见安捷伦应用简报使用 Captiva EMR-Lipid 和 LC-MS/MS 对人血浆中的 THC 和代谢物进行高效定量分析3 。

实验部分：试剂与化学品 ∆9 -THC、11-羟基-∆9 -THC、11-nor-9-∆9 -羧基-THC、∆9 - THC-d3、11-羟基-∆9 -THC-d3 和 11-nor-9-羧基-∆9 -THC-d9 购自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)。LC-MS/MS 级甲酸铵同样购自 Sigma-Aldrich。所有溶剂均为液相色谱级或更高级别，均购自 Burdick and Jackson (Muskegon, MI, USA)。溶液在甲醇中配制浓度为 10 µg/mL 的 THC 及其代谢物 THC-OH 和 THC-COOH 的混标工作溶液。将氘代 THC-d3、THC-OH-d3 和 THC-COOH-d9 混合到工作溶液中，浓度为 10 µg/mL（溶于甲醇中），并用作内标 (IS)。校准标样和质量控制样品在预加标质量控制 (QC) 样品中加入适当浓度的标准工作溶液，平行配制七份。QC 样品为低浓度 QC (LQC)、中等浓度 QC (MQC) 和高浓度 QC (HQC)，分别对应于全血中 1、10、 50 ng/mL 的浓度。在每种浓度的 QC 样品中，添加浓度为 50 ng/mL 的氘代混标溶液 (IS)。在经过 Captiva EMR-Lipid 净化的空白基质中，用 THC 及其代谢物的工作溶液后加标，其加标浓度分别对应于全血中 1、 10、50 ng/mL 的浓度。另外，还加入一份 5 µL 的 1.0 µg/mL IS 溶液。基质匹配校准曲线由标准工作溶液制得。对经过 Captiva EMR-Lipid 净化的空白基质进行后加标，加标浓度对应于提取物中 0.5、1、5、10、50、100 ng/mL 的浓度。在每种浓度的校准标样中加入 5 µL 1.0 µg/mL IS。

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结果与讨论：去除不需要的脂质基体 EMR-Lipid 方法简便，通用于极性、中等极性和非极性的目标物分析，可消除基质效应并改善分析物回收率。EMR-Lipid 利用*的吸附剂化学作用，用水活化 EMR-Lipid 吸附剂后，能通过体积排阻和疏水性相互作用选择性捕集脂类（图 2）。脂类上的无支链烃链进入吸附剂中，而体积较大的分析物并不进入其中。然后，进入吸附剂中的脂链通过疏水相互作用被捕集。PPL 是细胞膜的主要成分，大量存在于全血中。PPL 是由磷酸酯和胆碱单元组成的亲水性头部基团以及由长链烷基组成的疏水性尾部构成。