临床研究中红细胞脂肪酸谱的测定-化学电离气相色谱串联质谱仪

摘要：细胞脂肪酸 (FA) 谱被*为各种人类疾病的生物标记物，通常采用安捷伦气相色谱质谱联用系统 (GC/MS) 对其进行分析，而这种方法非常费时费力。因此临床研究中需要一种高通量的分析方法。在本研究中，从红细胞 (RBC) 中提取 FA 后进行衍生化，以生成脂肪酸甲酯 (FAME)。采用氨气诱导化学电离 (CI) 的气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) FA 谱分析法专为人 RBC 的分析而开发。有 703 个 RBC 样品采用 GC/MS/MS 进行了 FA 谱分析。将该分析方法与采用电子轰击电离 (EI) 的单杆 GC/MS 传统方法进行比较。氨气诱导 CI 分析能够生成足够数量的分子离子，以对 FAME 进行进一步研究。该分析确定了 45 个 FA 谱的特定碎片，用于实现可靠的定量分析和碎裂。使用传统 GC/MS 的典型分析时间长达 60 分钟，但该 GC/MS/MS 分析方法的运行时间仅为 9 分钟。分析的所有 FA 批间与批内变异小于 10%。将氨气诱导 CI 与 GC/MS/MS 分析相结合，可帮助临床研究实验室实现稳定、可靠的高通量 FA 谱分析。

前言为了测定临床研究实验室中的脂肪酸 (FA) 谱，需要灵敏的特异分析方法。过去分离 FA 谱采用的是气相色谱 (GC) 结合火焰离子化检测器 (FID)，这个组合使研究人员能够分析不同基质中的单个 FA1 。质谱 (MS) 的引入改善了这种分析方式2 ，但传统 GC/MS 分析需要长时间的色谱分离才能确保可靠的鉴定和定量。本研究开发并验证了一种用于红细胞 (RBC) 等生物样本中 FA 高通量分析的特异、快速而灵敏的分析方法。为此，使用化学电离 (CI) 与气相色谱串联质谱 (GC/MS/MS) 结合来测定 FA。采用这些技术可得到过去使用 GC/MS 进行 FA 分析的改进方法。

化学品与试剂异丙醇、甲醇和己烷（GC 级）购自 Fisher Scientific (Schwerte, Germany)。水（LC/MS 级）和BF314% 甲醇溶液）购自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany)。硫酸钠 (Na2SO4) 购自 Merck (Darmstadt, Germany)。经认证的 37 种脂肪酸甲酯 (FAME) 混合物 (TraceCERT) 购自 Sigma-Aldrich (Hamburg, Germany)。另一种 FAME 混合物购自 NuChekPrep (Elysian, MN, USA)，包括内标 C17:1（十七碳烯酸甲酯）在内的所有其他 FAME 均购自 Larodan (Malmö, Sweden)。使用常规实验室分析提交的 EDTA 抗凝血液等分试样。按照 “赫尔辛基宣言 II”向受试者详细说明，并获得使用不具名实验室数据的知情同意。

样品前处理为从血红细胞中提取 FA，将 0.5 mL 全血和 10 mL 0.9% 盐水混合，并在 2500 g 下离心 5 分钟。弃去上清液后，重复一次清洗步骤。之后加入 1 mL 蒸馏水使细胞溶解，并在冰箱的低温条件中储存至少 30 分钟。然后将 FA 提取物与 5 mL 内标 (IS) 溶液混合，并在 2500 g 下离心 5 分钟。IS 溶液含有 0.2 mg/mL FAC17:1 己烷/异丙醇 (3:2) 溶液以及 3 mL Na2SO4 溶液 (6.7%)。然后将己烷相转移到干净的玻璃管中并用氮气将样品蒸干。在分离 FA 时，加入 1 mL BF3 甲醇溶液 (14%) 并在 100 °C 下温育 10 分钟进行酯化。然后，冷却至室温后，将 1 mL 水和 3 mL 己烷加入样品中，并在 2500 g 下离心 5 分钟。将己烷相转移至干净的样品瓶中，用氮气蒸干。终的 FAME 样品溶于 250 mL 己烷中，可储存在 –25 °C 条件下。分析前将样品以 1:20 的比例用己烷稀释。数据分析采用 Agilent MassHunter 软件进行数据采集 (Waldbronn, Germany)。为了对 FAME 进行正确鉴定和定量，用两个碎片离子，一个用于定量，另一个用于确认。校准标样中采用 45 种 FAME（表 1）的混合物。将单个 FA 浓度计算为评估的 FA 集合中 100% 的相对百分比，或计算为值。采用 MassHunter 定量分析软件 5.0 和 MassHunter 定性分析软件 5.0 进行数据分析。使用分析物与内标的峰面积比值计算校准曲线。方法参数为了测定 GC/MS/MS 分析方法的线性和准确性，使用了 45 种 FAME 混标在己烷和混合人红细胞中的一系列稀释溶液。方法的准确性同样用 45 种 FAME 混标在三个不同浓度范围内进行评估。为了评估批内精度，对一份人血液混合样品的 10 个等分独立样品进行分析。以相同方式测定批间精度，但将样品分散在不同天中测定。使用在分析当天配制的校准标样测定浓度。计算精度的相对标准偏差 (RSD)。对人血样品的分析灵敏度重复测定 10 次。根据所选分析物的信噪比 (S/N) 计算检测限 (LOD) 和定量下限 (LLOQ)。使用 MassHunter 定性分析软件计算信噪比。

结果与讨论 安捷伦GC/MS 分析为比较 EI 和 CI 两种电离方法，在 FAME 分析中展示了二十二碳六烯酸甲酯（DHA，C22:6n3）的谱图。图 1A 中，采用 EI 的 GC/MS 谱图显示出大量低质量数碎片。m/z = 67、m/z = 79 和 m/z = 99 等某些碎片是 LC-PUFA 的特征性碎片，而这些碎片不具有化合物特异性。采用 EI 碎裂方式后，通常无法检出 FAME 的分子离子。相反，采用 CI 时，GC/MS 谱图中主要的峰为分子离子 ([M+H]+ )，m/z = 343（图 1B）。氨气用作 CI 的反应气，因此其他的主要峰为氨加合离子 ([M+NH4] + )， m/z = 360。两种碎片都具有化合物特异性，因为 MS/MS 模式中消耗的氨（[M+NH4] + & [M+H]+ ）可用作定量离子对。