对人全血中的滥用药进行LC/MS/MS 定量测定

摘要： Agilent Captiva 增强型脂质去除产品 (EMR-Lipid) 是第二代 EMR-Lipid 产品，采用便捷的 SPE 过滤柱或 96 孔板。本研究展示了采用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板对人全血中的 24 种代表性滥用药进行 LC/MS/MS 定量测定。样品的前处理方法为：采用孔内蛋白质沉淀法 (PPT) 去除蛋白质，然后采用 Captiva EMR-Lipid 净化产品去除脂类。通过以下方式对该方案进行改进：首先加入全血样品，然后加入沉淀溶剂以促进实现*的孔内 PPT。整个样品处理在 96 孔板中作为一个批次执行，并通过离心或正压歧管完成样品洗脱。整个过程简单、快速，能够在两小时内完成 96 个样品的前处理。高效基质净化产品使磷脂去除率高于 99%，从而减小了基质离子抑制效应和系统污染。通过为期三天的准确度和精度运行对定量方法进行验证，在所有加标浓度下均获得了优异的准确度 (100±20%) 和精度 (RSD < 15%)，全血中的定量限 (LOQ) 为 0.1–0.5 ng/mL，且线性校准曲线的 R2 高于 0.995。结果表明，采用孔内 PPT 和 Captiva EMR-Lipid 净化产品建立的方案显著改善了人全血中滥用药化合物定量测定结果的可靠性。

前言：在法医毒理学中，对快速可靠地筛查和定量测定生物样本中的滥用药 (DoA) 的需求正在不断增加1–3，主要原因是滥用药以及提交分析的样品数量日益增多。过去，选择尿液样品进行筛查和鉴定。但是，必须对这些药物的代谢物进行鉴定，由此增加了定量检测的复杂度和不确定性。血液样品（包括全血、血浆和血清）的分析日益重要。初，血浆是定量分析选择的主要样品基质，但是随着样品前处理和仪器检测技术的改进，全血已成为鉴定和定量分析的基质。与尿液相比，使用血液作为样品进行分析具有若干项优势。 • 首先，这种技术能够在体内代谢和过滤之前立即检测药物 • 其次，因为生理参数变化的范围非常窄，血液相对均匀 • 再次，几个欧洲国家和美国一些地区要求毒驾 (DUID) 测试采用血液样品4 因此，可靠地定量测定血液基质（尤其是全血）中的 DoA 对于常规毒理学分析非常重要。目前使用气相色谱/质谱联用系统 (GC/MS) 和液相色谱串联质谱联用系统 (LC/MS/MS) 对 DoA 进行毒理学检测。然而，GC/MS 方法通常很耗时，并且通常需要在分析之前对分析物进行化学衍生5 。 LC/MS/MS 分析技术的优势在于检测速度更快，且具有更高的灵敏度、选择性和稳定性6 。用于系统毒理学分析的样品前处理方法包括液液萃取 (LLE)、固相萃取 (SPE) 和固相支持液液萃取 (SLE)。这些方法费力费时，并需要使用大量有毒溶剂。安捷伦增强型脂质去除产品 (EMR-Lipid) 吸附剂是一种新型吸附材料，能够选择性去除样品基质中的主要脂类且不会造成分析物损失。EMR-Lipid 吸附剂提供的脂质去除机制是基于脂质化合物与这种*的吸附剂之间的体积排阻和疏水作用。这种相互作用机制能够在 PPT 之后从生物体液中高选择性且高效地去除磷脂及其他脂类。第二代 EMR-Lipid 吸附剂以 SPE 过滤柱/板形式包装，只需使样品通过吸附剂即可完成净化。研究表明，使用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板进行孔内 PPT，随后进行流通式净化，能够有效去除生物体液中的磷脂，并实现人血清中代表性药物的定量测定7,8。为证明 Captiva EMR-Lipid 96 孔板对于法医学检测的可行性，本研究选择 24 种常见的 DoA 化合物。表 1 列出了所选化合物的化学特性和结构。使用为期三天的准确度和精度测试以及基质净化评估对方法进行验证。

实验部分：试剂与化学品所有试剂和溶剂均为 HPLC 或分析纯级。乙腈 (ACN) 购自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。试剂级甲酸 (FA) 来自安捷伦（部件号 G2453-85060）。乙酸铵和氢氧化铵购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。混合 DoA 标准储备液（1 µg/mL，溶于甲醇 (MeOH) 中）来自安捷伦（部件号 5190-0470-1）。人全血样品来自 Biological Specialty Corp. (Colmar, PA, USA)。内标 (IS) 储备液（1 mg/mL，溶于 MeOH 或 ACN 中）购自 Cerilliant (Round Rock, TX, USA)。标样和溶液利用混合 DoA 标准储备液和单独的 IS 储备液配制标样和 IS 加标溶液。在 20:80 甲醇/水中配制浓度为 200 ng/mL 的标样加标溶液，用于对校准标样和质量控制 (QC) 样品加标。用 20:80 甲醇/水将单独的 IS 储备液稀释至 2 µg/mL，制得 IS 加标溶液，并将该 IS 加标溶液直接加入样品中。将 385.3 mg 乙酸铵溶于 1 L Milli-Q 水中，然后加入 1 mL 甲酸 (FA)，制得含 0.1% FA 的 5 mmol/L 乙酸铵缓冲液，作为流动相 A。将 1 mL FA 加入 1 L 乙腈中，制得含 0.1% FA 的乙腈溶液，作为流动相 B。将 400 µL NH4OH 加入 40 mL 预混合的 95:5 ACN/MeOH 中，新鲜配制溶于 95:5 ACN/MeOH 中的 1% 氢氧化铵 (NH4OH) 溶液。该溶液在使用前保存于 –20 °C 下。

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结论在人全血中 24 种代表性 DoA 化合物的定量测定中，对一种使用蛋白质沉淀和 Captiva EMR-Lipid 净化产品的样品前处理方法进行了验证。为期三天的准确度和精度运行结果证明，该方法提供了优异且紧凑的校准曲线线性、优异的日内和日间准确度和精度以及可接受的分析物回收率和基质效应。Captiva EMR-Lipid 净化产品使全血基质中的磷脂获得了优异的去除率。在孔内 PPT 过程中，首先加入全血样品，然后加入沉淀溶剂，由此改善了样品混合均匀性并促进蛋白质*沉淀。采用 96 孔板形式开发的方案适用于高通量实验室对快速、可自动化的样品前处理方法的需求，便捷的孔内 PPT 和 EMR-Lipid 净化产品简化了工作流程，同时仍可提供高效的样品提取和基质净化。更干净的分析样品还可缩短清洗仪器检测系统所需的时间，改善样品检测通量和数据质量。