使用（HR-MAM）对 NIST单抗的关键质量属性进行监控

1.前言 随着治疗性生物产品在药物市场所占份额的不断提高，各 国监管机构通过发布质量源于设计（Quality by Design, QbD） 原则等手段，对生物药的质量控制提出了更高的要求。对于生 物制药企业而言，在生产及批次放行过程中对关键质量属性 （critical quality attribute, CQA）和杂质等进行鉴定、定量和监 控就显得尤为重要。传统的质控手段包括多种分离手段，如反 相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)、体积排阻色谱（size-exclusion chromatography, SEC）、离子交换色谱（ion-exchange chromatography, IEX）和毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）等。 2015年，Rogers等基于Orbitrap高分辨质谱平台发展了MultiAttribute Method（MAM），用于在一针进样中同时对CQA进行 鉴定、定量和实时监控[1]。自从MAM发布以来，获得了业界的 关注，在近年的学术会议中屡屡成为热点议题[2]。

在本文中，我们使用Thermo Scientic™ Q Exactive™ Plus Orbitrap™ 高分辨质谱平台，串联Thermo Scientic™ Vanquish™ Flex UHPLC系统，使用Thermo Scientic™ Chromeleon™ 7.2.9 Chromatography Data System (CDS) 与Thermo Scientic™ BioPharma Finder™ 3.2 软件进行数据采集和处理(Figure 1).

Figure 1. Thermo Scientic HR MAM 工作流程图. 使用BioPharma Finder 软件对肽图分析的数据进行分析，与发现阶段进行对比以鉴定CQAs； 随后将BioPharma Finder生成的CQA列表导出至变色龙CDS中进行常规 GMP阶段符合合规要求的目标组分检测。

 2. 实验方法

a. 仪器及试剂 • Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer • Vanquish Flex UHPLC system • Thermo Scientic™ Accucore™ Vanquish™ C18+ UHPLC column, 1.5 μm, 2.1 × 150 mm • Thermo Scientic™ Acetonitrile, UHPLC-MS grade • Thermo Scientic™ Pierce™ Trypsin Protease MS grade • Thermo Scientic™ Pierce™ Formic Acid, LC-MS grade • Invitrogen™ UltraPure™ 1 M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 • 8.0 M Guanidine Hydrochloride Solution • Bio-Spin P-6 Gel Columns, Tris Buffer • Thermo Scientic™ Zeba Spin Desalting Columns, 0.5mL • Sodium Iodoacetate (IAC) BioUltra >98% purity • DL-Dithiothreitol (DTT) BioXtra ≥99% purity

b. 实验样品 NISTmAb Humanized IgG1κ Monoclonal Antibody (NIST, RM 8671)。

c. 样品前处理步骤 • 商业化NIST mAb标准品以溶液形式提供，溶于 12.5 mM Lhistidine + 12.5 mM L-histidine HCl (pH 6.0)体系中，浓度为 10.004 ± 0.08 mg/mL。取两份10 μL NIST mAb标准品，分 别标记为RA2和RA3，各加入90 μL Solution I(7 M GuanidineHCl, 100 mM Tris, pH 8.3)，将其浓度调整为1mg/mL。 • 还原：向上述样品中分别加入2.0 μL Solution II (500 mM DTT) ，使DTT终浓度为10 mM，随后室温孵育30分钟。 • 烷基化：还原结束后，向上述样品中分别加入4.0 μL of Solution III(500 mM IAC)并用移液器充分混合，使IAC终浓度为20 mM，避光室温孵育20分钟。 • 溶液置换：烷基化结束后，向上述样品中分别加入4.0 μL Solution IV (50 mM DTT)用于中和过量的IAC。随后分别取 BioSpin-6 column和Thermo Scientic™ Zeba Spin Desalting Columns, 0.5mL各一支，按照其说明书分别将其溶液体系置 换为50 mM Tris（pH 7.9）。弃去下层溶液并更换新的1.5mL 外管，随后向BioSpin-6 column中加入经还原烷基化之后的 RA2样品，向Zeba Spin Desalting Column中加入经还原烷基 化之后的RA3样品，1000×g转速离心四分钟后分别收集下层 溶液准备酶解。 • 酶解：使用双蒸水将Pierce Trypsin复溶为1mg/mL,温和涡旋混 匀。按照酶：蛋白=1:10（w:w）的比例将胰酶溶液分别添加 至前述两份NIST mAb样品中，37 °C孵育30分钟，加入甲酸 （终浓度为10%）终止酶解反应，随后将两份样品分别转移 至样品瓶中并置于液相自动进样器里，待后续分析。

 d. 实验方法设置 • 液相色谱：Vanquish Flex UHPLC system • 色谱柱：Accucore Vanquish C18+ UHPLC column (1.5 μm,2.1 × 150 mm) • 柱温：50 °C（column oven Mode set to Still Air） • 自动进样器温度：5°C • 上样量：每个样品4 μL(约4μg酶解肽段) • 流动相： 0.1% formic acid in water (A1) / 0.1% formic acid in acetonitrile (B1) • 流速：0.250 mL/min. 

质谱条件如表2所示。其中用于肽图分析的数据使用Top5 ddMS2 方法采集，BioPharma Finder 处理；CQA定量的数据使 用Full Scan MS only 方法采集，变色龙软件处理。

 Table 2. 质谱条件. e.数据处理软件 使用Thermo Scientic BioPharma Finder 3.2软件进行肽图分 析，参数设置如表3所示。对两份样品的MS/MS数据进行搜 库，以确定用于监控和定量的CQA。

参考之前的报道，在本文的研究中我们选定了如下的CQAs用于 定量：糖基化（glycosylation）、脱酰胺（deamidation）、天 冬氨酸异构化（isomerization）和C端赖氨酸丢失（C-terminal lysine truncation）。对于每个CQA，我们选取了鉴定到的每个 电荷态的前四个同位素峰，在BioPharma Finder中另存为Target Peptide Workbook，并一键导出为BioPharma Finder workbook le (.wbpf)，随后将其导入变色龙 Processing Method中的 MS Component Table。 任何新发现的CQA可以随时添加进BioPharma Finder workbook 和变色龙方法中，这为方法开发和优化阶段提供了灵活 性。一旦在变色龙软件中建立了标准化的分析方法，即可将该 方法应用于GMP环境下的应用中。 接下来，使用Chromeleon CDS 7.2.9软件进行CQA定量。我们 基于变色龙软件中的MS Quantitative模板创建了MAM数据处理 的方法，基本参数如表4所示。在变色龙软件中，可以对峰积分 的参数进行优化，以确保积分结果一致且可信，从而得到准确 的定量结果。

 3.实验结果 本次实验选取的两份NIST mAb标准品来源于同一批次，通过 对比不同溶液置换耗材处理后选定CQA含量的变化趋势，进而 研究不同耗材对CQA定量结果的影响。图2展示了Biopharma Finder对两个样品进行肽图分析的结果，可见在上样量约4μg肽 段的情况下，NIST mAb标准品轻链覆盖度≥96%，重链覆盖度 ≥98%，除了一些胰酶酶切过短的肽段没有鉴定到，其余区域均 可鉴定到肽段信息，为CQA的选取和定量提供了坚实的基础。 Figure 2. 两份NIST mAb标准品（RA2, 上；RA3, 下）酶解肽段基峰谱 图（Base Peak Chromatogram）. 对于两个样品，我们分别进行了三针技术重复。表5展示了对主 要糖型的定量结果。由图中可以看出，分别使用不同前处理耗 材的两个样品的六针进样之间均呈现良好的重现性。

图3A展示了肽段FNWYVDGVEVHNAK上D283的异构化比率和 N289的脱酰胺比率。由图中不难发现，两种不同溶液置换条件 下天冬氨酸异构化和脱酰胺化比率并没有显著差异，表明对于这 两种修饰，使用不同溶液置换耗材也无显著差异。 以RA2样品为例，进一步观察发生天冬氨酸异构化和未修饰峰的 对比，可见由于修饰/未修饰肽段色谱保留时间的差异，可以将 其分离开，在变色龙软件中按照保留时间差异进行相应设置，分 别提峰进行相对定量(图3B)；得益于Orbitrap质谱的高灵敏度，相 对含量只有未修饰峰约0.15%的异构化峰也可以检测到高质量的 一级质谱图和准确的肽段同位素峰分布(图3C-F)。

 4.结论：在本实验中，我们使用基于Thermo高分辨质谱平台的HR-MAM 流程对在前处理步骤中使用不同溶液置换耗材的NIST mAb标准 品进行了CQA的鉴定和定量。得益于HR-MAM流程的稳健性、 灵活性、特异性和高灵敏度，我们可以在一次实验中同时对多个 CQA进行监控和定量。 对比不同溶剂交换前处理耗材的实验结果，可发现肽图强度、色 谱峰型及分离与肽图覆盖度等无明显差异，且与关键质量属性相 关的特定修饰，使用不同耗材处理得到的定量比率并无显著区 别，更进一步证明了HR-MAM流程的稳定性。