使用LC-MS/MS系统对神经酰胺和己糖基神经酰胺进行高通量靶向筛查

应用优势 ■ 快速定量血浆和血清中的24种神经酰胺、 23种己糖基神经酰胺以及鞘氨醇 ■ 使用Quanpedia™和SOP构建性能稳定、便于部署的平台，降低方法开发和培训成本 ■ 使用TargetLynx™软件和第三方信息学软件（即Skyline）实现快速数据处理和数据可视化 ■ 比同类工作流程更快、更经济

简介鞘脂(SLs)是脂质中的一类，包括神经酰胺(Cer)、鞘磷脂(SM)和较为复杂的鞘糖脂。所有SLs都有一条“长链”，也就是鞘氨醇碱基链1 。这些碱基是鞘氨醇(SPH)等有机脂肪族氨基醇或者结构相似化合物（图1）。这些化合物是细胞膜的重要组成部分，与多种生物功能有关，包括细胞信号转导和细胞凋亡2,3。SLs在诱导肿瘤细胞增殖、研究化疗耐药机制方面起着关键的作用4 ，另外已有研究发现，帕金森患者体内的神经酰胺(Cer)和己糖基神经酰胺(HexCer)含量偏高5 。 SLs代谢转化快、代谢物种类繁多且功能相似，给单独研究某一种鞘脂的功能带来了很大难度。

虽然质谱(MS)技术的进步让研究人员得以进行更深入的脂质组学分析，但鉴定和定量分析依然比较困难。脂质有大量的同分异构和同量异位物质。此外，MS谱图中通常有多种化合物的峰和碎片，要想对特定的分子进行明确鉴定和相对定量，不仅难度大，而且极为耗时。这严重阻碍了实验室之间的脂质组学数据传递，导致研究人员难以通过多地点研究得出生物学解释。本研究使用基于亲水作用色谱(HILIC)的方法分离不同类别的脂质，然后使用MS进行检测，从而降低了鉴定结果的不确定性6 。按照图2. 大多数研究实验室的通用脂质组学工作流程，图中突出显示了LipidQuan工作流程。类别分离不同的脂质还可以减少定量分析所需的稳定同位素标记(SIL)标准品，进而降低成本。本应用纪要介绍了在LipidQuan平台（图2）上运行基于HILIC的方法对Cer、HexCer、SPH进行的靶向筛查。

实验：样品向混合的健康人血浆中添加稳定同位素标记(SIL)的SLs（氘代CERAMIDE LIPIDOMIX™，Avanti Lipids，美国亚拉巴马州阿拉巴斯特），制备九个不同浓度的标准品用于绘制定量用标准曲线。分析物的浓度范围如下：C16神经酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0) = 2.2-1090 ng/mL、C18神经酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)= 1.2-575 ng/mL、C24神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0) =2.6-1315 ng/mL、C24:1神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1) = 1.3-665 ng/mL。另外，通过萃取前加标的方式向NIST标准参比物质® 1950血浆中（Sigma Aldrich，英国普尔）添加5% SIL，制备6个重复样。样品制备样品制备方案很简单，使用预冷的异丙醇(IPA)沉淀蛋白（1:5，血浆:IPA）即可。将样品涡旋混合1 min，在-20 °C下放置10 min。接着再将样品涡旋混合1 min，然后在4 °C下放置2 h，确保蛋白沉淀*。将萃取的样品在4 °C下离心10 min（大离心力10,300 g），然后将上清液转移至玻璃样品瓶，进行LC-MS/MS分析。

实验 LC条件 LC系统： ACQUITY UPLC I-Class液相色谱系统固定定量环(FL)或流通针式(FTN) 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 × 100 mm, 1.7 µm 柱温： 45 °C 流速： 0.6 mL/min 流动相A： 95:5乙腈/水 +10 mM醋酸铵流动相B： 50:50乙腈/水 +10 mM醋酸铵梯度： 流动相B在2 min内从0.1%升至20.0%，然后在3 min内从20%升至80%，随后重新平衡3 min 运行时间： 8 min 进样体积： 1 µL MS条件 MS系统： Xevo TQ-S micro、Xevo TQ-XS和Xevo TQ-S 电离模式： ESI (+) 毛细管电压： 2.8 kV (+) 采集模式： MRM 离子源温度： 120 °C 脱溶剂气温度： 500 °C 锥孔气流速： 150 L/h 脱溶剂气流速： 1000 L/h 雾化气： 7 bar 离子导入装置偏移1： 3 V 离子导入装置偏移2： 0.3 V

信息学软件创建LipidQuan Quanpedia方法文件（1.4版），其中包含LC条件、MS方法以及相关的TargetLynx处理方法（包括保留时间和 MRM通道）。使用TargetLynx或Skyline（华盛顿大学MacCoss 实验室软件）处理所得数据。

结果与讨论 LipidQuan使用正离子模式MRM对人血浆中的Cer和HexCer类物质进行定性和定量，同时还能分析其它脂类，如TG、PC、 SM。在HILIC分离条件下，Cer在溶剂前沿洗脱（大约0.4 min 处），HexCer和SPH类脂质洗脱为分离的峰（大约0.8-1.1 min 处），如图3所示。总共分析了24种Cer、23种HexCer和SPH。得益于该方法的灵敏度，使用50 µL血浆可轻松检测出人血浆中正常循环水平的这些脂质，其线性动态范围覆盖4个数量级。此处讨论的Cer和HexCer脂质通道使用的是脂质母离子及其特征长链碱基(LCB)子离子(m/z 264)（图1）。通道列表见表1和表2。使用萃取前加标已知浓度SIL标准品的血浆样品制备标准曲线用于定量分析。采用相同条件制备和分析内源性脂质的替代标准品，对同类内源性脂质进行了定量分析。使用市售的预混合SIL 溶液而非每种待测脂质的SIL，可以显著降低大规模研究的总体成本。SIL标准品C16神经酰胺-d7 (d18:1-d7/16:0)、C18神经酰胺-d7 (d18:1-d7/18:0)和C24神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:0)的标准曲线示例如图4所示，可用于定量内源性的Cer和HexCer。使用氘代CERAMIDE LIPIDOMIX SIL标准品绘制标准曲线时，若典型R2 值＞ 0.95，且与拟合直线的偏差(CV) < 30%，则视为标准曲线可接受。C24:1神经酰胺-d7 (d18:1-d7/24:1)的标准曲线不符合此标准。由于事先已开发好LipidQuan Quanpedia方法文件，用户只需下载用于分析Cer和HexCer脂质类别的MRM通道和色谱条件即可，无需手动输入LC-MS方法，因此避免了可能出现的抄录错误