使用Agilent LC/MS/MS 分析鸡蛋中的硝基咪唑

摘要：本应用简报描述使用简单、稳定的通过式净化和 安捷伦LC/MS/MS 分析测定鸡蛋中的 4 种硝基咪唑（甲硝唑、迪美唑、罗硝唑和异丙硝唑）及其羟基代谢物。采用 QuEChERS 萃取和 Captiva EMR-Lipid 过滤柱净化的样品前处理步骤获得了优异的脂类和色素去除结果。该方法在 3 个 QC 浓度下均呈现出出色的准确度 (85.6%–118.3%) 和精密度 (RSD < 6%)。

前言：硝基咪唑是用于家禽的一类活性抗生素，也可用作食品动物的生长促进剂。然而，由于存在潜在风险，许多国家/地区已禁止使用这类化合物1 。已有一些有关使用溶剂萃取2,3 和固相萃取 (SPE)4 来分析硝基咪唑的报道。但是，溶剂萃取通常采用乙酸乙酯或二氯甲烷等强溶剂，这些溶剂可萃取额外的基质，从而在 LC/MS 分析期间造成干扰4 。SPE 方法包括乙腈萃取及随后的阳离子交换固相萃取柱的净化，该方法可得到洁净的洗脱液，但在样品前处理期间需要多个步骤和多次 pH 调节。 Captiva EMR-Lipid 是一款脂质去除产品，其将体积排阻与疏水相互作用两种净化机制相结合，能够选择性地捕获脂类烃链，同时不损失目标分析物。相比 SPE 的多步骤操作，EMR *的通过式功能可大大简化样品前处理工作流程。本应用简报在分析鸡蛋中的硝基咪唑及其羟基代谢物时使用 Captiva EMR-Lipid 进行样品净化，得到了优异的回收率和精密度。图 1 显示了 4 种硝基咪唑及其代谢物的化学结构。

实验部分：试剂与化学品所有试剂和溶剂均为 HPLC 或分析纯级。乙腈 (ACN) 和甲醇 (MeOH) 购自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。甲酸 (FA) 购自百灵威科技有限公司（中国北京）。硝基咪唑和内标购自 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany)。溶液与标准品单个标准品储备液由甲醇配制成 10 mg/mL，置于棕色容量瓶中并在 –20 °C 下储存。混合标准品加标溶液 (1 mg/mL) 和内标混合物 (1 mg/mL) 在使用前由甲醇配制。

仪器与材料：采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱执行分离操作，该液相色谱与配备安捷伦喷射流电喷雾电离 (EI) 离子源的 Agilent 6495B 三重四极杆液质联用系统联用。Agilent 9000 气相色谱系统联用 Agilent 7000 GC/MS 三重四极杆系统，利用 GC/MS 全扫描评估基质的去除情况。采用 Agilent MassHunter 工作站软件进行数据采集和分析。其他的样品前处理所用的设备和材料包括： • SPEX 样品前处理 2010 Geno/Grinder (Metuchen, NJ, USA) • Eppendorf 5810R 离心机 (Hamburg, Germany) • Agilent Captiva EMR-Lipid 过滤柱， 3 mL，300 mg（部件号 5190-1003） • Agilent Vac Elut 20 真空萃取装置（部件号 12234101） • 用于兽药的 Agilent QuEChERS 萃取试剂盒（部件号 5982-0032）

样品前处理图 3 展示了样品前处理过程。将鸡蛋样品混合均匀并准确称量 (5 g)。然后，配制含 5% 甲酸的乙腈溶液用于提取。实验表明，高比例的甲酸可实现更好的蛋白沉淀效果，产生更多的沉淀。选择包含 4 g Na2SO4 和 1 g NaCl 的 QuEChERS 萃取包来净化鸡蛋样品中的极性干扰物。离心后，移取上层乙腈相 (2.4 mL) 至洁净的试管中，加入 0.6 mL 水进行稀释（水的体积百分比为 20%）并充分涡旋混合。然后，将混合溶液转移到 3 mL Captiva EMR-Lipid 净化管中，使其在重力作用下流过净化管。然后真空干燥过滤柱。后，收集并涡旋洗脱液，待进样。校准标样和质量控制 (QC) 样品用于标准曲线的校准标样溶剂的配制浓度为 0.1、0.5、1、5、10、50 和 100 ng/g。包含 DMZ-D3、MNZ-D4 和 MNZOH-D2 的内标混合物的加标浓度为 10 ng/g。将适量的标准工作溶液加入均质化蛋样品中，得到预加标的 QC 样品，其中涵盖低浓度 (1 ng/g)、中等浓度 (5 ng/g) 和高浓度 (10 ng/g)，各平行配制 6 份。

结果与讨论线性使用 Agilent MassHunter 定量分析软件处理数据。使用线性回归拟合和 1/x 加权得到 7 种硝基咪唑和代谢物的校准曲线，其 R2 值均在 0.993–0.995 之间。回收率和精密度结果表 1 显示运行 3 个 QC 浓度的加标样品对先进行 QuEChERS 萃取，然后进行 Captiva EMR-Lipid 净化的方法的验证结果。回收率为 86.5%–118.3%，RSD < 6%。由于内标数量有限，因此用 MNOH-D3 校准 MNZOH，用 MNZ-D4 校准 MNZ，用 DMZ-D3 校准 DMZ、RNZ、IPZ 和 IPZOH。由于 HMMNI 具有不同的化学特性，因此未用任何内标对其进行校准