多维度+深度的生物药表征：全新一代Exploris 240质谱

多维度+深度的生物药表征：全新一代Exploris 240质谱

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赛默飞在今年质谱年会上重磅推出两款智能化Exploris系列质谱——Orbitrap Exploris™ 120和Orbitrap Exploris™ 240。之前两期wei信稿已经详细介绍了其在代谢组学和蛋白质组学中的应用，本期小编将分享下Orbitrap Exploris 240在生物药表征中的应用，Exploris 240具有高灵敏度、高分辨率和高质量精度等特性可确保其采集的数据可信可靠，因此在该简单、灵活、稳定的质谱分析平台上可实现生物药多维度的深度的表征分析。

爱尔兰国家生物工艺研究培训所（NIBRT）是赛默飞的合作者，他们用 Exploris 240对单抗样品进行了肽图和二硫键的分析；非变性分子量和电荷变异体的分析；以及多维度氧化翻译后修饰的深度表征分析，具体的应用实例见下文。

应用实例1: IgG2单抗的肽图和二硫键分析

在肽图分析中一级氨基酸序列分析可确定抗体序列的正确性，产品相关关键质量属性的低丰度翻译后修饰的鉴定和监测可以确保药物的质量、疗效和安全，二硫键能保持生物药的稳定和确保其功能正常，所以肽图和二硫键分析是生物药表征*的项目。在Exploris 240质谱平台对IgG2单抗Denosumab进行肽图和二硫键的常规表征分析，分析流程如下图所示。

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在肽图分析中需要获得高序列覆盖率，CDRs区和关键区域需要被检测到。得益于Exploris 240的高选择性、高捕获率和高灵敏度等特性，Denosumab仅用一种酶切的结果中，轻重链蛋白序列覆盖率即均达到100%，表明蛋白序列正确。

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高灵敏度使得低丰度翻译后修饰能轻松被检测到，下图为低丰度的脱酰胺翻译后修饰，一级质谱提供高质量精度的结果，质量偏差小于3 ppm，通过二级谱图中特征碎片b2和b3离子对脱酰胺修饰位点定位充分确定。

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比较还原和非还原Denosumab样品来确定其二硫键的连接方式，链内和链间二硫键均鉴定到，一级质量偏差均小于3 ppm。

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小结：

Orbitrap Exploris 240可以用于生物药的常规表征，仅用一种酶切即可实现抗体轻重链100%序列覆盖，高灵敏度带来高可信的低丰度翻译后修饰的鉴定结果，高分辨率带来超高的质量精度鉴定结果，Biopharma Finder对复杂数据分析轻松得到可信的链内和链间二硫键鉴定结果。

应用实例2: 非变性条件下对IgG1单抗变异体的高灵敏度表征

非变性条件下获得的蛋白分子量质谱图与变性条件下相比，其电荷价态之间能有更大的空间分离和更少的重叠状态。通过液相分离酸性和碱性蛋白异构体后质谱检测蛋白质平均质量和保留时间对单抗电荷变异体（CVA）进行鉴定。

Orbitrap Exploris 240非变性质谱和CVA分析流程如下图所示，其中非变性质谱使用尺寸排阻色谱(SEC)分离和CVA使用阳离子交换色谱(CEX)分离。

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SEC-MS分析曲妥珠单抗稀释液，上柱量0.05-50.0 μg，在m/z 5000到7000所有数据点都能清楚地检测到，绘制相对于上样量和多个电荷价态归一化强度的标准曲线。检测限LOD = 0.03μg，定量限LOQ = 0.08μg。从结果可知，Exploris 240分析低含量的蛋白质不影响谱图质量，检测低含量的糖基化修饰是可行的。

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CEX-MS CVA分析需要非常高的质谱灵敏度，以确保对低丰度电荷变异体的可靠鉴定。2号单抗的CEX-MS分析显示，与未修饰样品相比，该突变样品具有丰富的酸性异构体，对应的是脱酰氨类的洗脱早于未修饰的成分。在BPC图中也观察到其他形式的异构体（如：加K和片段化的形式），所有的异构体丰度都≤3%。

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小结：

Orbitrap Exploris 240非变性质谱操作简单，获得的数据谱图信噪比高和质量精度高。在非变性质谱条件下进行完整的分子量分析，具有超高的灵敏度，可以对痕量样品进行可靠的分析。离子交换色谱结合Exploris 240的可以在有限的样本量研究中对单抗的异质性进行深入的表征和可靠的鉴定。

应用实例3: 在完整蛋白、亚基和肽段水平对IgG1单抗氧化翻译后修饰的多维度表征

氧化是生物药在生产和存贮中发生的常见的翻译后修饰之一，甲硫氨酸尤为敏感，氧化修饰作为关键质量属性会影响到终药物的安全性和有效性，需要被检测和监测。Exploris 240高分辨质谱可以鉴定到低丰度的氧化修饰和在肽段水平提供特征的二级碎片离子进行位点鉴定，确保鉴定结果的可信可靠。

单抗Ipilimumab和golimumab分别从蛋白、亚基和肽段水平进行分析以评估氧化的情况，分析流程如下图所示。

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完整蛋白水平氧化翻译后修饰的鉴定：如下图所示，对比Ipilimumab对照品和强制氧化样品，放大其中一个52+电荷价态质谱峰，糖型峰基线分离，信噪比高，3个糖型的质量偏差小于4 ppm，强制氧化的样品与对照品相比有约64Da的质量差值，表明在完整蛋白水平可能有4个甲硫氨酸发生了氧化修饰

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亚基水平氧化翻译后修饰的鉴定：Ipilimumab用Ides酶解和TCEP还原后得到Fc/2，LC和Fd’亚基，如下图所示在mAbPac色谱柱上3个亚基得到非常好的分离。放大28+质谱峰可见三组样品（对照，50 ppm H2O2和500 ppm H2O2强制氧化样品）质谱峰基线*分离，电荷价态可识别，BioPharma Finder软件用Sliding window xtract算法对他们进行去卷积，得到各亚基单同位素分子量和检测到Fc/2亚基的氧化形式。

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肽段水平氧化翻译后修饰的鉴定：如下图所示，检测到重链胰酶酶切肽段DTLMISR上发生约+15.9949 Da的质量差值，表明强制氧化的样品甲硫氨酸上发生氧化修饰。发生修饰和未发生修饰的样品一级质量精度高，质量偏差均小于1ppm。二级谱图中特征碎片y5和y6离子能确定氧化修饰发生的位置，以及谱图中中性丢失64 Da (CH3SOH)碎片离子进一步提高结果的可信度。

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肽图水平氧化翻译后修饰的鉴定结果跟完整蛋白，亚基水平氧化翻译后修饰结果相互验证、相互支持。Biopharma Finder软件自动计算出ipilimumab 和 golimumab氧化修饰比例。在ipilimumab高浓度的双氧水中甲硫氨酸氧化修饰比例都增加，从4个甲硫氨酸氧化发生的比例和氧化速率的不同，可以推测Fc端更多暴露在单抗的外表面，从而更容易被氧化。

小结：

Exploris 240质谱提供在完整蛋白、亚基和肽段水平上可信的检测和监测单抗的CQAs平台，操作简单，质量准确性高。在完整的单抗水平上，对大多数的糖基化修饰的完整蛋白分子量的质量偏差小于4 ppm。通过与BioPharma Finder 4.0软件相结合，使用滑动窗口和Xtract去卷积算法能够快速、可信的对单抗亚基和低水平内源性氧化翻译后修饰质谱数据去卷积，得到单同位素峰分子量。肽段鉴定一级质量精度高，一级质量偏差小于1ppm，鉴定结果可信可靠。

此外，值得一提的是从控制仪器，数据采集，数据分析和生成报告都可以在变色龙软件中进行，对于后续将Exploris 240用于QC分析提供保证，该平台完*全符合法规的要求。

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结语

在生物药发现、开发、CMC和QC不同阶段对质谱需求不同，赛默飞基于orbitrap高分辨质谱在生物制药各个环节都有完整的解决方案。Exploris 240优异的性能使得能对生物药更加全面和深度的表征，在生物药的检测和监测中得到更加优异的数据，同时还能减少分析时间，带给用户更*的分析性能和体验。

重磅 6月16日

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