人血浆中缓激肽的SPE LC-MS/MS定量检测方法开发

缓激肽是一种含有9种氨基酸的生理和药理活性肽，由蛋白质的激肽基团衍生而来（图1）。激肽是可以促使血管舒张、血管通透性增强、一氧化氮释放和花生四烯酸流动的效应因子。它是血压、肾功能和心脏功能的重要调节因子，还参与炎症反应1 。缓激肽可引起血管扩张，从而导致血压降低。因此，对这种激素肽的变化进行高灵敏度、高选择性和高准确度地定量，并将其作为疾病进展或药物治疗的评估指标，将会极为有利。尽管以往都是通过配体结合试验（LBAs）对生物制剂进行定量分析，但在过去几年中利用LC-MS/MS分析大分子已成为一种趋势。这在某种程度上是因为LBAs产生显著的交叉反应问题并且缺乏标准化。沃特世液质LC-MS/MS具有多种优势，例如开发时间更短、准确度和精度更高、可重复进样，并且容易区分相似度很高的类似物、代谢物或内源性干扰物。常见的肽通常难以通过LC-MS/MS进行分析，这是因为其不易离子化以及不易产生理想的碎片离子而导致MS灵敏度较低，从而使得 LC和样品制备方法开发非常困难。由于缓激肽在血浆中的浓度低至pg/ mL水平且代谢速度快，在采血和样品制备过程中还可通过蛋白水解人为生成，因此对其进行准确定量相当困难。

本研究采用了专门设计的血液收集技术以防止体外缓激肽的形成，并且利用混合型固相萃取（SPE）和高效实心核颗粒色谱柱，大限度降低并消除基质干扰的同时提高定量分析的灵敏度。

在m/z 531和m/z 354观察到缓激肽的2+和3+母离子。缓激肽（图A）和IS（图B）的3+母离子的典型MS/MS谱图如图3所示。在方法开发过程中，记录了一些不同的多电荷母离子和碎片离子。终使用了缓激肽和IS的3+母离子，因为它们在基质中强度高且选择性佳。选择m/z 419.18 y31+的碎片离子作为缓激肽定量分析的主要碎片离子。选取3+母离子和m/z 408.18 b41+碎片离子用于确证。对于IS，选择了m/z 344.94的3+母离子和m/z 386.03 b72+碎片离子。MS条件如图2 所示。尽管许多肽可以生成小于m/z 200的较强碎片离子，但在提取样品中这些离子（通常为亚胺离子）由于缺乏特异性，会导致高背景噪音。在此检测中，采用m/z值大于其母离子的高特异性b或y碎片离子显著提高了特异性，便于使用更为简单的LC和SPE方法。

结论：本研究开发了一种用于提取人血浆中缓激肽的混合模式 SPE提取方法。μElution SPE提取板消除了蒸发操作需求，并且利用非特异性结合和样品浓缩而大大降低了损失的可能性。通过一种快速、简单、分析级的LC方法将缓激肽与相似度很高的内源性干扰物分离开来，LC总运行时间仅为 3.5分钟。与传统的C18全多孔色谱柱相比，CORTECS UPLC C18 实心核颗粒色谱柱改善了峰形，提高了缓激肽检测的灵敏度。CORTECS UPLC C18色谱柱、混合型弱阳离子交换SPE以及 m/z较高的b或y MS碎片离子的联合使用提供了理想的选择性和灵敏度水平，从而实现了准确定量并从200 μL血浆中区分缓激肽浓度细微差异。标准曲线在5-10000 pg/mL的范围内准确精密。在高于基底浓度的情况下可精确定量的缓激肽低浓度为5 pg/mL。所有浓度的QC样品均符合FDA法规标准4,5 ，平均准确度范围为99.8-106.8，平均CV%为0.5- 5.5。以上数据证实了这是一种准确且可重现的方法。本研究还证实了采用合适的蛋白酶抑制剂样品收集方式对于准确测定缓激肽内源性浓度的重要性。此外，如果需要执行进一步验证，本方法在通过LC-MS/MS对PK和临床研究的患者样品进行高灵敏度的缓激肽定量方面也表现出巨大的潜力。