安捷伦6470系统对沙坦药物中的多种亚硝胺类基因毒性杂质进行定量分析

摘要：本文介绍了采用配置 APCI 源的 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统，同时检测沙坦 药物中六种亚硝胺类基因毒性杂质 NDMA、NDEA、NMBA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA 的 方法。该方法涵盖了欧美药检系统截止到 2019 年 11 月提到的全部亚硝胺类基因毒性杂 质，操作简单、特异性高，且灵敏度满足目前*，适用于沙坦类原料药和部分制剂 中 6 种亚硝胺类基因毒性杂质的快速筛查和准确定量。

前言：2018 年 7 月，缬沙坦原料药被曝出含有亚硝胺类基因毒性杂质 N-亚硝基二jia胺 (NDMA)， 9 月份，该类药物又曝出含有另一种亚硝胺类杂质 N-亚硝基二乙胺 (NDEA)。2019 年 3 月，第三种亚硝胺类杂质 N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸 (NMBA) 在氯沙坦钾中检出超标[1]。 沙坦类降压药的全名是“血管紧张素受体阻断剂”(ARB)。由于此类药物都带有“沙坦” 二字，因此俗称“沙坦类降压药”，是目前治疗高血压的一线降压药，使用广泛。亚硝胺 (Nitrosamine) 是一类通式为 R1 N(–R2 )–N=O 的胺化合物，结构如图 1 所示，其大部分成 员都属于强致癌物。根据世界卫生组织癌症研究机构公布的致癌物清单，从沙坦类降 压药中发现的 NDEA、NDMA 属于 2A 类致癌物，即“对人很可能致癌，此类致癌物对人 致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分”[2]。另外，根据 FDA 的初步评估，NMBA 暴露风险与 NDMA 相同[1]。

目前，关于沙坦类药物中亚硝胺的检测，可以在上查到欧洲 OMCL 实验室和 FDA 公布的 GC/MS、LC 和 LC/MS 方法。其中， FDA 在 2019 年 8 月公布了 LC-HRMS 方法和 RapidFire-MS/MS 方法[3, 4]，对沙坦类药物中可能含有的 6 种亚硝胺类基因毒性杂 质进行筛查和半定量分析。FDA 提出，除先前检出的 NDEA、 NDMA 和 NMBA 以外，根据文献报道和工艺研究，还有三种亚 硝胺类杂质可能存在于 ARB 药物中，分别是 N-亚硝基乙基异丙 基胺 (N-nitrosoethylisopropylamine, NEIPA)、N-亚硝基二异丙 基胺 (N-nitrosodiisopropylamine, NDIPA) 和 N-亚硝基二丁基胺 (N-nitrosodibutylamine, NDBA)。鉴于 LC-HRMS 和 RapidFire-MS/MS 配置比较特殊，且无法用于准确定量分析，我们参考 FDA 方法， 开发出采用常规 LC-APCI-QQQ 配置同时检测沙坦药物中 6 种亚硝 胺类基因毒性杂质的方法。所开发的方法操作简单、特异性高， 且灵敏度满足目前*。

实验部分：试剂和样品 甲醇为质谱级，甲酸为色谱级，购于 Merck；所用实验用水为 Millipore Milli-Q 超纯水系统现制备的高纯去离子水；6 种亚硝胺 标准品和样品由合作用户提供。

仪器和设备：采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱系统与 6470三重四 极杆液质联用系统。液相色谱系统配备如下：二元泵（部件号 G7120A）、自动进样器（部件号 G7167B）、柱温箱（部色谱柱选用 Agilent InfinityLab Poroshell PFP（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件号 695775-408）。如果沙坦类样品色谱保留较强 （如缬沙坦和厄贝沙坦），也可以用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件号 695775-902）进行 分离。件号 G7116B）。

标准溶液制备 精确称取 6 种亚硝胺标准品，加甲醇超声溶解，并定量稀释制成 每 1 mL 中约含 10 mg 目标化合物的高浓度标准品溶液。用水逐 级稀释成每 1 mL 中分别包含约 0.1、0.5、1、5、10、50、100、 500、1000 ng 目标化合物的溶液，作为标准品线性系列溶液。线 性范围和相关浓度点可根据检测需要自行调整。

样品前处理：将 100 mg 沙坦类样品研磨后，溶于 10 mL 水中，用超声提取 10 分钟，过滤后分析。 对于水溶性欠佳的沙坦样品，先用大约 2 mL 甲醇溶解后，经超声 提取后，用水稀释到 10 mL，再次超声提取 10 分钟，滤除沉淀后 进行分析。终浓度以 API 计为 10 mg/mL。

结果与讨论：色谱分离结果 本文参考 FDA 方法，基于窄内径 Poroshell 系列色谱柱低柱压、 高柱效的优势，适当降低了流速，缩短了梯度时间和平衡时间。 不同沙坦类药物在反相色谱体系中保留能力不同。因此，本文分 别对缬沙坦和厄贝沙坦进行了测试，两者在常规 C18 色谱柱上可 以分离。而氯沙坦钾保留相对较弱，需要采用 PFP 色谱柱以改善 API 的保留特性，确保分子量较大的 NDBA 获得理想的回收率。 洗脱梯度起始采用高比例水相，需要注意复溶样品的有机相不宜 过高，否则会影响分子量较小的 NDMA 的峰形和灵敏度。梯度后 半段采用高比例有机相洗脱沙坦类 API。由于 API 浓度很高，为 避免污染质谱系统，建议此时将流路设置为“引入废液”。 在本文中所用的色谱条件下，6 种亚硝胺之间及杂质与 API 之间 分离度良好，典型的 TIC 色谱图如图 2 所示。因为受限制的 N-N 键存在顺反结构 (syn and anti conformers)[5]，NMBA 和 NEIPA 在 色谱体系中表现为双峰，在定量分析时，需要对两个峰积分并合 并峰面积[1]。 ×104 +TTC MRM (** -> **

结论： 根据 FDA 的报告，沙坦类药物中含有或可能含有 6 种亚硝胺类 基因毒性杂质，即 NDMA、NDEA、NMBA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA。本文采用配备 APCI 源的 6470 三重四极杆液质联用系 统，同时检测上述 6 种亚硝胺类化合物，方法简单、特异性高、 重现性好，灵敏度满足目前 FDA 规定的*。实验中测试了 不同的沙坦基质，采用适合的色谱柱和色谱方法，可以很好地满 足灵敏度和回收率要求。另外，通过将方法设置为将高浓度药品 基质引入废液而不引入离子源，可减少对质谱系统的污染。该方 法适用于对沙坦类原料药和部分制剂中的 6 种亚硝胺类基因毒性 杂质进行快速筛查和准确的定量分析。