残留宿主细胞蛋白质的液质分析方法

目前针对重组蛋白质药物中杂质蛋白质的 分类主要包含两种： 1) 产品相关杂质 （Product-related impurities）；2) 过程相关杂 质（Process-related impurities）[1] 。其中产品 相关杂质主要是在生产和储存过程中产生， 包括母药降解产物、聚合物、翻译后修饰 （脱氨、糖基化、二硫键错配、氧化等）， 可通过肽图及修饰、寡糖分析，二硫键解析 进行分析。而过程相关杂质主要包括宿主细 胞蛋白质（Host cell protein，HCP）、蛋白质 纯化中用到的Protein A等。

重组蛋白质药物一般由哺乳动物细胞表达 生产，生物制品中残留的宿主细胞蛋白质 (HCP)作为外源蛋白质可能在不同程度上引发 机体的免疫应答，终导致过敏反应或其他 不良反应，因此必须建立合适的检测HCP的方 法监控生物制品的质量。认识残留HCP的风险、 建立合适的残留HCP检测方法、控制生物制品 的质量显得尤为必要。 目前，上针对HCP 的残留*尚无统一标准，生物制药公司采 用风险控制(risk management)来设置HCP的残 留*[2] 。美国 FDA规定, 用一种灵敏度较高 的方法检测药品中的 HCP, 其含量应该低于检 测限 ( 通常小于100 ppm) [3] 。国内来看，《中 华人民共和国药典》2010年版三部规定CHO细 胞残余蛋白质占总蛋白质含量的0.05%以下[4] 。 这提示研发单位在这个研发周期中需要将HCP 残留作为重要的质量控制项目。目前针对HCP 分析的主要难点在于成分复杂，可能包含上 千种残留蛋白质，其动态范围为4至5个数量 级；另外，相对重组蛋白质药物，HCP含量较低（ppm级别），对检测方法的灵敏度和动态 范围要求较高。

宿主蛋白质检测方法不仅是保证生物制品 安全有效的关键, 也是生产过程控制和工艺优 化的重要参数。目前, 宿主蛋白质检测方法常 用的HCP分析方法有十二烷基硫酸钠-聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二维(2D)电泳、高 效液相层析(HPLC)、蛋白质印迹(Western blot) 和酶联免疫吸附试验(ELISA)等[5] 。其中，ELISA 仍然是相对应用较广泛的HCP检测方法, 主要 是由于其技术相对简单、灵敏度较高，并可 提供数字化的定量结果，便于设定检测限度 和建立技术规范。但是ELISA方法也存在一系 列的缺点，比如动态范围较窄（<100），存 在抗体交叉反应带来的结果误判，且开发周 期长, 费用高 (>$100K)、失败风险高，商品化 的试剂盒无法涵盖所有过程特异性的HCP无法 发现由于工艺改变等引起的新出现的HCP蛋白 质的等问题。

与传统的ELISA方法相比，液相色谱质谱联用（LC-MS）方法具有开发时间短（只需几 周），可特异性地对所有HCP进行确证和定量， 对所有杂质蛋白质无偏性检测，且方法动态 范围高（可达6个数量级），方法调整快等优 点。因此液质联用分析HCP已经成为业内关注 的热点。但是，HCP实验面对的是蛋白质种类 众多、复杂、样品丰度差异巨大的分析对象， 并且需要获得蛋白质定性与定量的完整信息， 因此对质谱硬件要求*。但从另一方面看， HCP所面临的复杂体系蛋白质鉴定与定量任务，

杂蛋白质组学中的大规模蛋白质鉴定与定量 工作的分析任务*一致。甚至，在蛋白质 组学迅猛发展的十年间，实验人员已经对更 为复杂的样本体系，如血浆、肝脏、脑、尿 等进行了深入分析。因此，*可以借鉴蛋 白质组学积累的丰富的质谱使用经验。

在蛋白质组学研究中，静电场轨道阱 (Orbitrap) ，是业内*的分辨率高、质量精 度准、灵敏度高、动态范围宽的质量分析器。 其中Q Exactive是四极杆和orbitrap的组合质谱 平台，其不但具有异常强大的蛋白质鉴定能 力[6] ，而且Q Exactive还*颠覆了传统对高 分辨质谱定量能力不足的认识，次在一 个仪器平台同时兼顾了的定性与定量性 能。而且其小巧的体积，简单的操作，维护 便捷，使得高分辨质谱能够进入更多的实验 室。

图1为单抗产品的HCP液质分析策略示意 图。实验分为两个部分。首先是HCP的鉴定与 初步定量。在这一步，为了降低实验难度， 不需要使用已经完成所有纯化步骤的产品作为样品，而是使用上游的半成品分析。其中， 刚完成离心富集，以及刚经过Protein A纯化得 到的中间产品是较为理想的分析对象。这是 因为，这两个步骤的样品中，HCP的相对丰度 较成品高，而利于HCP的鉴定发现。当获得 HCP及其特征肽段的列表后，就可以使用这些 信息进入第二步骤——HCP监控分析。在这一 步，目标分析物为终产品，并采用以对目 标蛋白质进行定量为目标的定量质谱法— —选择离子监控质谱法或平行反应监测质谱法。

在HCP鉴定发现步骤中，主要采用DDA （Data Dependent Acquisition）质谱法进行蛋 白质的鉴定，一级采用全扫描模式，二级谱 图根据一级谱图中不同质荷比离子的强度信 息（Top N）依次进行触发。Q Exactive采集速 度高达12Hz，具有蛋白质鉴定能力。 Matthew等以酵母细胞为分析对象，在四小时 的分析时间内，Q Exactive可同时鉴定到4,206 个蛋白质，动态范围达5个数量级，并且可鉴 定到丰度极低的蛋白质 （ less than 50 copies/cell）[7] 。其高通量、宽动态范围、高 灵敏度的特点非常适合于重组蛋白质药物中杂质蛋白质的高通量定性要求。另外，可利 用一级质谱图中杂质蛋白质特征肽段的峰面 积进行相对定量，这样就可同时完成杂质蛋 白质的鉴定和定量。定量方法如iBAQ蛋白绝 对定量算法。此方法将所有蛋白多肽的质谱 响应强度加权平均，并利用48种标准浓度蛋 白测定的校正曲线自动校准，终获得样本 中蛋白的含量，动态范围可达6个数量级 相应工作已于2011年发表在了Nature主刊中[8] 。 免费的MaxQuant蛋白分析软件内置了iBAQ定 量功能，可以轻松、地获得目标蛋白在 样品中的相对丰度。

在残留宿主细胞蛋白质分析的第二步（对 已鉴定的HCP进行目标监控与定量）实验中， 平行反应监测法（PRM）的表现更为突出。 PRM法是基于Q Exactive基础的目标蛋白质定 量方法。它不但具有高灵敏度、宽线性范围、抗基质噪音能力强、同时定性定量、方法设 置简单、无需方法优化等性能优点[9] 。加之仅 在一个Q Exactive平台就可完成HCP的全部分析 任务。因此还具有了高性价比的经济优势。 在HCP的质谱分析实例中，Katrin等人使用 Orbitrap型质谱监控重组蛋白质药物纯化过程 中宿主蛋白质的变化，并在终药物中鉴定 到多种低丰度的宿主蛋白质,对蛋白质纯化方 法的优化具有重要参考意义[10] 。

综上，Q Exactive在一个仪器平台上实现 了重组蛋白质药物宿主细胞蛋白质的发现鉴 定及定量监测要求，并与专业蛋白质解析软 件组成蛋白质药物杂质蛋白质分析完整解决 方案，技术流程简单、成熟、通过了大量的 高水平研究与实践，非常适合生物制药企业 在研发周期中将其作为残留HCP质量控制的质 谱分析平台。

更多信息请点击：液相色谱质谱联用（LC-MS）