当前位置:化工仪器网-质谱网首页-技术文章列表-赛默飞质谱在蛋白质药物代谢分析中的应用

赛默飞质谱在蛋白质药物代谢分析中的应用

2019年08月14日 15:53 来源:赛默飞色谱及质谱

经典的蛋白药物代谢分析采用配体结合实 验(Ligand-Binding Assay,LBA)技术,其中以 酶联免疫吸附实验法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)为代表,该技术 对设备要求低,易于操作,灵敏度高。但 ELISA方法存在一些缺陷,如:受自身抗体干 扰、定量范围窄、非特异性结合、交叉反应、 以及免疫原性影响等问题。近年来备受关注 的串联质谱方法(LC-MS/MS),在进行蛋白 药物代谢分析中,可提供的选择性,良 好的准确性、性、以及宽定量范围,并 具有开发时间短(约几周时间),分析通量 高与多重分析能力的特性。因此,串联质谱 法在蛋白药物代谢分析中的应用日渐增多, 并已经形成了系统的分析方案,可见综述论 文[1,2] 。

 

蛋白类药物代谢定量液质分析流程如图一。 通常情况下,起始样品量为几至几百微升血 液,分析需经过1)蛋白纯化,2)酶解,3) 多肽纯化,4)色谱分离,5)质谱检测以及6) 内标添加等步骤。在实验中,直接的分析目 标并不是完整的蛋白药物本身,而是它的部 分片段——多肽。受到液质分析能力限制,分 子量大于4-5KDa的蛋白药物需要被处理到肽段 水平,并在酶解产生的众多肽段中,选择序 列*,可特异性代表蛋白药物的肽段——指 纹肽(Signature Peptide,SP)作为直接分析 对象(多肽类药物采用可直接分析的方法[3,4] )。 因此在蛋白药物代谢液质分析中,实际是对 指纹肽的确认与定量,也就是说通过指纹肽 代表蛋白进行分析。

 

与小分子药物代谢质谱分析相同,对指纹 肽的定量,需要相应的内标进行参照。 在解析质谱数据时,通过比较掺入的内标肽 与蛋白本身的指纹肽相对量,并与事先建立 好的标准定量曲线对照,完成定量。内标肽 是被选为指纹肽的稳定同位素标记形式 (Stable Isotope Labeled, SIL-),内标肽与其 对应的指纹肽具有相同氨基酸序列,除质量 差别外,两者具有相同的色谱与质谱行为。 此方法被称为同位素稀释-选择/平行反应监测 质谱法(Stable Isotope Dilution - Select/Parallel Reaction Monitoring MS, SID-SRM/PRM-MS) [5,6]

 

有三种内标肽添加方法:种是在初始 样品中直接添加同位素标记的蛋白形式的内 标(SIL-Standard Protein);第二种是在蛋白 纯化后,加入含有序列长度略长于指纹肽的 同位素标记的内标肽(SIL-Winged standard Peptide);第三种是在样品酶解后,加入与指 纹肽序列相同的同位素标记的内标肽(Simple SIL-Standard Peptide)。显而易见,内标加入 的越早,其与目标蛋白共同经历的处理步骤 越多,各种操作造成的影响越一致,终的 定量准确度与重现性越好。第三种Simple SILStandard Peptide是根据参照指纹肽序列合成 的,其差别仅在于内标肽含稳定同位素(一 般使用C13、N15等重稳定同位素)。添加这 种内标肽的成本低,但其实验准确性较差。 对于SIL-Winged standard Peptide形式的内标肽 而言,除标记同位素外,其氨基酸序列较相 应的指纹肽延长了N及C端。这样延长的SILWinged Standard Peptide 就可以参与到酶切步

骤,因此其实验可靠性优于简单稳定同位素 内标。由于实验中往往需要至少2个以上的内 标肽,因此多个内标肽可以连续的方式合成, 形成首尾相接的形式(Concatenated Standard Peptide),可在一定程度上降低成本。在这 三种内标中 ,  因 为 SILStandard Protein将会与目标蛋白经历*相同 的处理过程,因此可以获得好的准确性与 重现性。

 

确定指纹肽是整个分析流程的基础,关键 的选择因素包括:1)特异性,2)酶切过程 中产生速度及重现性,3)在整个操作过程中 的化学稳定性,4)色谱中可保留,5)质谱 离子化效率高,质谱碎片质量好。指纹肽的 选择流程见图二。

 

在确定指纹肽的特异性时,可使用的软件 及数据库工具有: PeptideAtlas 、 Skyline 、 BLAST。由于指纹肽需要在全过程保持稳定, 因此,除序列特异性外,还需要对其氨基酸 组成进行选择,如不能含有不稳定氨基酸残 基及序列 , 如 : Methionine 、 Cystine 、 Tryptophan,相邻的 Aspartic acid 与 Glycine, 在N端的 Glutamine 或 Asparagine 等。为避免 Trypsin漏切,碱性氨基酸相连的情况,如ArgArg、Arg-Lys、Lys-Lys,也要被排除。指纹肽 的长度在8-15个氨基酸残基比较合适,序列太 短难于在色谱上保留,而序列太长可能会有 成本及质谱碎裂质量问题。此外,由于Proline 残基可以促进产生强的碎片信号,因此优先 选择含有Proline的肽段。有一些软件工具可以 帮助选择指纹肽,但诸如色谱共洗脱离子抑制,酶切效率等方面的考察,仍必须通过实 验来进行终确认。指纹肽的数量需要达到2- 3个以满足蛋白药质谱确证及定量。对于单抗 产品来说,由于其与内源性免疫球蛋白的高 度的序列同源性,有时非常难于选出多个特 异的指纹肽。对于只可选出一个指纹肽的样 品来说,可主要使用这个指纹肽进行确认及 定量,而其它不能满足全部要求的候选指纹 肽也可保留1-2个,作为辅助信息。

 

除选择指纹肽、添加内标策略选择等环节 外,蛋白纯化、酶切条件优化、肽段纯化、 液相分离与质谱分析各个环节都对终结果 的灵敏度、重现性有着重要的影响。蛋白纯 化步骤可减少基质干扰,提高目标蛋白相对 浓度。在这一步可选择技术包括:分子量过 滤,蛋白沉淀(Protein Precipitation, PP)、固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE),白蛋白 去除,以及针对含有IgG的Fc片段蛋白药物的 Protein A亲和富集。目前在酶切时,大多使用 胰蛋白酶(Trypsin),其主要步骤包括蛋白的 变性、还原、烷基化、酶切等。需要优化的 条件包括酶切缓冲溶液,酶切时间等。多肽 富集步骤可以进一步提高指纹肽浓度,有利 于实验灵敏度的提高。在蛋白药代谢液质分 析中,可选择的色谱方式包括Conventional (色谱柱内径大于1毫米),Capillary(色谱 柱内径介于0.1至1毫米),以及Nano LC(纳 升液相,色谱柱内径小于0.1毫米)三种。其 中色谱柱内径越大,数据的度及重现性 越好,但灵敏度较差。使用小内径色谱柱的 纳升色谱的灵敏度好,但操作难度较da, 色谱分析时间较长。

 

质谱监测是蛋白药物代谢定量分析的后 一环,也是关键一环。目前通常采用两类质 谱进行此类分析:三重四极杆质谱四极杆 - 静电场轨道阱质谱(Q - Orbitrap)。 两种质谱分别使用选择反应监测质谱法 (Select Reaction Monitor,SRM)与平行反应 监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)质 谱法。三重四级杆质谱结构中串联了四极杆-碰撞池-四 极杆三个主要部件。在SRM质谱方法中:众多 肽段经过色谱分离、离子化后,进入个 四极杆质量分析器中。在这里将只允许提前 设定的,接近指纹肽质量条件的离子通过,离子在通过后立即进入碰撞池并发生碎裂。 产生的碎片将进入后面的四极杆质量分析器, 只有符合预先设定的符合指纹肽碎裂特点的 碎片离子才能通过,并终到达检测器产生 质谱信号。通过两次质量选择,指纹肽信号 被从复杂的基质中分检出来,其强度被用于 定量(图3)[5,7,8,9] 。

 

Q-Orbitrap型质谱结构与三重四级杆质谱的主 要区别是,后端的质量分析器改为静电场 轨道阱(Orbitrap)。从信号扫描方式上看, 四极杆质谱在点时间上只能扫描一个信号值, 如果想扫描多个信号,就需要在不同的信号 域间不停地反复进行切换。而 Orbitrap 则可对进入的所有离子同时进行高分辨、高准确检 测。这是其质谱方法被称为平行离子监测的 原因(图3)。三重四级杆进行SRM的主要特点是可 进行超高频率的低分辨扫描;而Q-Orbitrap进 行的PRM方法特点为可进行高准确、高分辨扫 描,但扫描频率一般。

 

Amelia等详尽地对比了SRM与PRM的各项 性能[6] 。其中,在灵敏度、定量线性、重现性 等方面两者没有差别,但PRM在选择准确性与 定量范围上优于SRM,而SRM在定量精度上有 优势。总体比较,而两者在定量能力上基本 一致。但如果从实验流程的角度看,基于QOrbitrap的PRM方法还具*的优点:PRM方 法开发简单、时间短。这是因为SRM方法仅可 允许个别碎片离子进入检测器,为了得到好的效果,需要对所有候选的碎片进行选择 优化。而PRM在检测中一次性记录了全部的碎 片离子,省略了挑选碎片离子的方法开发过 程[6] ,并同时实现了定性与定量。还特别需要 指出的是,Q-Orbitrap具有超高分辨优势,背 景基质越复杂,其抗噪音能力越强于三重四级杆质 谱[6] 。显而易见,因为当背景杂质复杂程度加 大时,近似内标肽段特性的干扰杂质将越多, 而三重四级杆质谱只具备单位分辨能力(约几百ppm 分辨能力),其对杂质的过滤作用就远不如 具有高分辨能力的Orbitrap(小于5ppm分辨) 质量分析器。

 

此外,由于Q-Orbitrap为超高分辨串联质 谱,因此,除了可对特定多肽进行定量分析 外,对于完整蛋白分子量测定、肽图及修饰、 二硫键、寡糖及糖肽分析、宿主细胞残留蛋 白鉴定与定量等众多分析项目都是Q-Orbitrap 型质谱的分析强项。由于一台Q-Orbitrap具备全面且强大的分析性能,使其性价比远远优 于传统的使用Q-TOF与三重四级杆两台质谱来完成从 蛋白表征到定量工作的组合[6,10-15] 。

 

目前单抗类药物的给药量一般为 1- 10mg/kg,在血中的浓度从ug/mL到sub-ng/mL, 因此其期望定量限可到 sub-ng/mL 水 平 。 Mireia等采用附着生物素及抗抗体磁珠的免疫 富集技术,使用微升液相与TSQ Vantage Triple Quadrupole 质谱联用 , 实现了血清中 7.03 ng/mL到450 ng/mL的单抗的定量[7] . Duan等使 用纳升液相与TSQ Quantum Triple Quadrupole 质谱联用,在血浆中实现了12.9 ng/mL至32.3 µg/mL的单抗定量范围[9] ,在不同组织中达到 了0.156 至 0.312 μg/g的单抗定量限[8] 。Paul等 在血浆中使用Q-Exactive Quadrupole Orbitrap 质谱实现了Cetuximab单抗在血浆中 从6.60 到 660 pmol/mL (19.8 to 1980 fmol on column)的 定量[11] 。Gu等使用PRM法测定大鼠血浆中人 重组干扰素含量的实验中,实现了sub-ng/mL 定量,定量范围达到6个数量级(图4)[15] 。 简要来说,使用Q-Orbitrap进行蛋白代谢 分析具有如下优点: • 高灵敏度 • 宽线性范围 • 抗基质噪音能力强 • 同时定性定量 • 方法设置简单 • 无需方法优化

 

质谱技术可有效地解决ELISA方法做蛋白 药物代谢分析时遇到的自身抗体干扰、定量 范围窄、非特异性结合、交叉反应、以及免 疫原性影响等问题。而且,随着质谱技术的

不断发展,特别是以Orbitrap为代表的,性能 高,稳定性好,操作简单的质谱的推广应用, 以及更高灵敏度的三重四极杆质谱的推出,加之纳升液相与免疫富集等方法的辅助,蛋 白药物代谢分析即将进入全新的技术时代。

 

更多信息请点击:四极杆 - 静电场轨道阱质谱(Q - Orbitrap)

关键词: Orbitrap

免责声明

  • 凡本网注明“来源:化工仪器网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:化工仪器网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其他来源(非化工仪器网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。