分析硝基呋喃代谢物的实验方法

硝基呋喃类抗生素药物及其代谢物具有制畸胎副作用，且能诱发癌症，引起了人们的高度关注。欧盟、美国、中国等诸多国家和地区先后禁止在动物源性食品中使用，检测限为不得检出。硝基呋喃原药对光敏感，在动物体内迅速被代谢，故检测在食品中的代谢物。

化学试剂

硝基呋喃（nitrofuran）化合物名称、分子式和CA号：

呋喃它酮 3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinon，其代谢物为AMOZ，C8H15N3O3，CAS: 43056-63-9

呋喃唑酮 3-Amino-2-oxazolidinone ，其代谢物为AOZ，C3H6N2O2，CAS: 80-65-9

呋喃西林 Semicarbazide，其代谢物为 SEM，CH5N3O，CAS: 57-56-7

呋喃妥因 1-Amino-hydantoin ，其代谢物为AHD，C3H5N3O2，CAS: 2827-56-7

硝基呋喃化合物及代谢物的结构：

A：将药物代谢物从组织中提取出来；B：药物代谢物与2-硝基苯jia醛(2-NBA，C7H5NO3，CAS: 552-89-6)的衍生化反应。建议的内标：D4-AOZ，D5-AMOZ，13C15N2-SEM，13C3-AHD。

色谱分离流动相的制备

1 M乙酸铵溶液：77 g乙酸铵溶解于1 L HPLC级的水中。

流动相A：在1 L HPLC级的水中，加入1 mL 1 M 乙酸铵溶液。

流动相B：在1 L HPLC级的甲醇中，加入1 mL 1 M 乙酸铵溶液。

样品制备(肉、虾样品)

基于 Leitner 等人提出的方法[1]：

1． 称取1g匀浆的组织样品；

2．加入内标；

3．加入0.125M盐酸和2-硝基苯jia醛(2-NBA)；

4．调节pH值为7.4；

5．离心；

6．用乙酸乙酯在 Extrelut 柱上提取上清液；

7．挥干溶剂；

8．用500µL流动相[水+1mM乙酸铵/甲醇＝90/10]。

回收率[2]：AOZ ～70%；AMOZ ～80%；SEM ～70%；AHD ～70%。

样品制备(肝脏组织)

基于Conneely等人提出的方法[3]：

1．称量5g浸水并匀浆过的肝脏组织，衍生化过夜；

2．将样品溶液pH值调成中性，用乙酸乙酯提取，挥干溶剂；

3．将残渣溶于6mL水中，上样到准备好的MAX柱上；

4．先用2%氨水溶液3mL清洗，然后用3mL甲醇进行洗脱，挥干溶剂；

5．将残渣溶于3mL水中，上样到准备好的HLB柱上；

6．先用2%乙酸溶液(溶剂：水+甲醇＝1/1) 3mL清洗；

7．然后用3mL溶于90%甲醇中的2%的氨水溶液进行洗脱。

样品制备(蜂蜜样品)

基于Blake等人提出的方法[1]：

1．加50µL内标溶液到5g蜂蜜中；

2．热水中超声5min，使混合均匀；

3．加入20mL 0.3M盐酸(混合300mL 1M HCl和700mL的水制成)，振摇使均匀；

4．加入1mL衍生化试剂(将1g 2-NBA溶解于50mL二甲亚砜DMSO中制成，用前新鲜配制)；

5．涡流混旋1min，使混合均匀，37℃保温16h进行衍生化；

6．加入2mL 1M磷酸缓冲液(磷酸缓冲液pH=7.4)，加入1M NaOH(7.3～8.2mL)到溶液pH=7±0.5，注

意：pH值不可以超过7.5；

7．加入15mL HPLC级的乙酸乙酯，涡旋混合5min；

8．在3000r/min离心10min，直至有机相与水相明显分层，如果没有很好分层，继续离心；

9．仔细转移上面乙酸乙酯层溶液5mL，到一干净的16mm×100mm的玻璃试管中，注意不要将下面水层溶液带入；

10．蒸发到只剩1mL左右；

11．再仔细转移出3mL上层乙酸乙酯溶液，到相同玻璃试管中；

12．蒸发到只剩1/2时，涡旋混合，再蒸发至干；

13．加入200µL甲醇进行溶解，再加入200µL水，混合均匀。然后取出200µL到样品瓶中，备用。

色谱分离条件

Agilent 1100 系统：G1312A二元泵系统、G1367A型自动进样器、柱温箱。

色谱柱：Phenomenex LUNA，3µm，C18(2)，150mm×2mm。

流动相：A相—水+1mM 乙酸铵；B相—甲醇+1mM 乙酸铵。

MS/MS检测

API 3000™ LC-MS/MS液质联用仪系统，TurboIonSpray® 离子源，正离子模式，MRM扫描方式。