TSQ8000Evo用于药物中低含量基因毒性杂质分析研究

【概述】

药品安全直接关系人类健康，近年来成为研究热点。以抗生素类药物为例，它的使用挽救了无数人的生命。与此同时,临床不良反应也客观存在,每年有数以万计患者的健康乃至生命与相关药源性疾病有关。这些不良反应的发生除与药物本身的药理活性有关外,与药品中的杂质尤其是毒性杂质也有很大关系。而药物的生产工艺决定了其杂质来源各异、种类众多、成份复杂且含量较低。基因毒性杂质是指直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变和致癌作用的物质。常用的缩写为PGLs和GTLs。可能产生基因毒性杂质的环节为：

1）新药合成；

2）原料纯化；

3）存储运输（与包装物接触）等。

有关基因毒性杂质的问题，通常使用相关指南，如2007年实施的EMEA（欧洲药品局），该指南为限制新活性物质中的基因毒性杂质提供了解决问题的框架和具体作法。2008年12月FDA发布的Guidance for industry---Genotoxicand Carcinogenic Impurities in Drug Substances andProducts:Recommended Approaches.

主要内容：1）指南发布的背景；

2）原料药和制剂中的基因毒性杂质生成的预防方法；

3）基因毒性杂质的分析方法、处理方法和减少方法等；

4）上市申请和临床研究申请的可接受限度；

5）草药原料药和制剂中基因毒性杂质的评估指南。

这里有必要引入TTC概念，TCC Threshold of ToxicologicalConcern：毒性物质*，也叫做毒理学关注门槛。一个未知基因毒性数据杂质的TTC=1.5微克/天。因此,有必要建立一种高灵敏度、高选择性的基因毒性杂质分析方法。

【实验/设备条件】

色谱方法

柱温箱：50℃（1 min）_10℃/min_220℃_20℃/min_250℃（3 min）；

进样口：不分流进样（1 min），进样口温度200℃；

载气流速：1.2 mL/min（恒流）

进样体积：1.0 µL

质谱方法

传输线温度：250℃；

离子源温度：300℃

扫描方式：定时扫描-SRM模式（Timed-SRM）

【实验/操作方法】

越来越多的药企及相关机构开始采用串接质谱技术解决此问题。本文应用赛默飞三重四极杆气质联用仪TSQ 8000 Evo建立了药物中三种常见杂质（4-硝基卞醇、氨基乙腈盐酸盐及4-氯乙酰乙酸乙酯）的分析方法。以4-硝基卞醇为例，其是合成抗生素亚胺培南的主要原料。而4-硝基苄醇对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性，甚至部分毒理学数据表明其具有一定的致突变性。

【实验结果/结论】

AutoSRM优化方法

AutoSRM是赛默飞*的方法优化功能。在进行二级离子对优化时，一般会涉及到多种仪器方法编辑（全扫描、子离子全扫描、选择反应监测扫描）、进样序列编辑、离子与碰撞电压的选择。这个过程相当繁琐和复杂，如果不能实现自动化，实验人员工作量会大大增加。AutoSRM功能将所有过程*实现自动化衔接，实验人员无需编辑复杂的仪器方法和序列，只需在已给出的一级离子或二级离子中选择合适的即可。甚至一针进样可以同时优化10个不同碰撞电压，大大提高实验效率。一般来讲，实验人员只需对混标进样三次，即可完成全部化合物的质谱方法参数，包括离子对信息及碰撞能量的优化。

图1.前体离子优化

图2.子离子优化

图3.碰撞电压优化

结果

甲醇配制混标，记为“母液”。4-硝基卞醇、4-氯乙酰乙酸乙酯及氨基乙腈盐酸盐浓度分别为2.56 ppm、10 ppm、3.75 ppm。甲醇稀释母液，分别稀释450倍（记为Std-1）及2500倍(记为Std-2)

表1.混标浓度（µg/L）

表2.灵敏度实验结果

图4.混标Std-2的色谱图

非目标物分析

气质进行非目标物分析时，往往是全扫描结合NIST等商业谱库进行。去卷积功能可以发现更多化合物，但从其中筛出特征性组分的难度随着化合物数量的增加而显著增加。Tracefinder工作站的unknown screening插件，在去卷积及谱库检索功能的基础上可对样品进行差异分析。

采用分流进样，Fullscan全扫，分别采集仪器空白、溶剂空白以及不同样品。利用该软件进行峰对齐并做热图分析。组分的响应越大，热图显示的颜色越深。而颜色相差越大代表该组分在不同样品之间的差异也越大。也可将峰对齐结果直接导出，利用第三方统计学软件进行相关分析。由此，可快速找出样品特征组分，大大提高了工作效率。

图5.热图分析部分结果表

表3.部分化合物定性检索结果

结论

三重四极杆气质联用仪以出色的选择性及高通量等特点，正逐步应用于药物中杂质尤其是具有基因毒性的杂质分析中。TSQ 8000 Evo具有业界高的灵敏度，其设计与推出旨在提高实验室效率。*的AutoSRM功能，能够快速优化方法参数。Unknown Screening插件能够在去卷积的基础上执行峰对齐及差异分析，可快速找出差异性或特征性组分。因此，TSQ 8000 Evo非常适合药物中目标物定量及非目标物的定性分析。

【仪器/耗材清单】

质谱仪：TSQ 8000 Evo质谱仪（赛默飞世尔科技，美国）；

气相色谱仪：Trace 1310气相色谱配AI 1310自动进样器（赛默飞世尔科技，美国）；

色谱柱：TG-WAX MS30 m*0.25 mm*0.25 µm毛细管色谱柱；

试剂：甲醇；