超液质串联—检测鸡蛋过敏原

　　鸡蛋过敏的人群为广泛,国外已经出台了强制性标识食品过敏原的法规，而国内只有针对出口食品过敏源成分的标准，以实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法和环介导等温扩增检测方法为主，需要开发制定高灵敏度的直接对常见致敏蛋白的定性定量方法，并制定相应的标识法规。

　　目前用于过敏原检测的手段主要有酶联免疫(ELISA)法、PCR法和液相色谱-质谱联用技术。ELISA法是基于蛋白质的检测技术，是现在为成熟的方法，但是由于各种加工手段使蛋白质存在不同程度的变性，导致无法与抗体准确结合，而且ELISA法不可避免存在交叉反应且通量低，因此不适于对鸡蛋过敏原的准确定量。PCR法是基于DNA水平的检测手段，而非直接对致敏蛋白进行定量，但鸡蛋含有极少量的DNA，并且鸡蛋和鸡肉中的DNA没有差异性。近年来，液相色谱-串联质谱法广受关注，其基于特征肽段有效地解决了变性蛋白的定量检测问题，而且可以直接对蛋清致敏蛋白进行高灵敏度、特异性和准确度的检测。

　　质谱检测方法具有高灵敏度与特异性的优势，可通过超液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术建立鸡蛋过敏原卵白蛋白的定量检测方法，并进行线性关系、检出限、加标回收等方法学验证，将所建方法应用于实际商品中卵白蛋白的定量检测，以期对食品中鸡蛋过敏原的准确定量提供技术支持。

　　1、特征肽段的筛选

　　首先筛选卵白蛋白中的特征肽段。将前处理后的样品直接注入Easy-nLC 1000纳升液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱进行分离分析，将所得的肽段信息利用ProteinPilot软件和Uniprot数据库分析处理。与Uniprot数据库结果比对后，得到多条肽段。然后根据如下特征肽段的筛选原则进行特征肽段的筛选：以7～20 个氨基酸为宜;不含错切或漏切的酶切位点;不含甲硫氨酸;具有稳定的物理化学性质;进行定性定量分析时，具有较好的灵敏度和峰形。终筛选到3 段响应值较好、灵敏度较高的特征肽段，分别为LTEWTSSNVMEER(LR-13)、GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)、ELINSWVESQTNGIIR(ER-16)。所选择的3 条肽段通过Uniprot数据库进行BLAST搜索，确定肽段的唯yi性。

　　2、流动相及多反应监测参数优化

　　实验比较了乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸溶液2 种流动相体系在相同的洗脱程序条件下特征肽段的响应和出峰情况。结果表明，使用乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相，特征肽段的响应和峰形都要优于前者，拖尾现象明显改善，稳定性也有所提高。在电喷雾离子源正离子模式下，加入甲酸有助于肽类物质离子化进而提高分离效率和质谱信号的强度，故选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。

　　3、方法的线性关系、LOD和LOQ结果

　　分别精密移取混标储备液，用水稀释配制成1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的标准溶液，分别以3 条特征肽段的色谱峰面积为纵坐标(Y)，以各组分的质量浓度为横坐标(X)做线性回归方程，并计算该方法的线性范围。

　　4、基质效应的评价

　　基质效应大于100%时，表明基质对目标物离子化有增益作用;基质效应小于100%时，表明基质对目标物离子化有抑制作用。结果表明，饼干(95.05%)、面包(90.68%) 、挂面(88.53%) 对特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有不同程度的减弱作用，其中挂面的离子化抑制程度大;而蛋糕基质(112.60%)对特征肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)有增益作用。

　　5、加标回收率测定结果

　　卵白蛋白中定量肽段GGLEPINFQTAADQAR(GR-16)在基质饼干1中回收率在83.32%～95.66%之间，相对标准偏差(RSD)不大于9.97%;在基质饼干2中回收率在80.76%～98.55%之间，RSD不大于8.59%; 在基质挂面中回收率在77.22%～92.68%之间，RSD不大于5.13%;在基质蛋糕1中回收率在82.47%～86.56%之间，RSD不大于4.88%;在基质蛋糕2中回收率在79.41%～82.58%之间，RSD不大于8.31%;在基质面包中回收率在85.13%～91.36%之间，RSD不大于6.30%。

　　结论

　　通过蛋白质组学方法成功筛选到高特异性卵白蛋白肽段，并采用电喷雾质谱多反应监测模式实现了高灵敏度、快速定量。该方法的建立为食品中鸡蛋过敏原的检测提供了技术支持，为推动我国食品过敏原标识的监督与立法提供理论支持。